Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека

• Автор: Рафиева, Лола Маратовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Факторы роста нервной ткани
Понятие о факторах роста.
Классификация факторов роста нервной ткани
Открытие фактора роста нервов
Природные источники фактора роста нервов
Семейство нейротрофинов
Экспрессия нейротрофинов
в центральной и периферической нервной системе
Структура генов нейротрофинов человека
Внутриклеточный процессинг нейротрофинов.
Влияние продомена на эффективность процессинга
Секреция нейротрофинов
Структурная организация зрелых нейротрофинов
Структурные особенности пронейротрофина N0? и его пропептида.
Рецепторы нейротрофических факторов
Структурная организация рецепторов
Тирозинкиназные рецепторы
Рецептор р75
Сортилин
Структурные особенности взаимодействия нейротрофинов и их предшественников с рецепторами
Взаимодействие нейротрофинов с тирозинкиназными рецепторами.
Взаимодействие нейротрофинов с рецептором р75
Взаимодействие нейротрофинов с рецепторами Тгк и р75
Взаимодействие пронейротрофинов с сортилином

1.3.3. Сигнальные каскады, запускаемые при взаимодействии
нейротрофических факторов с рецепторами
1.3.3.1. Сигнальные каскады Trk-рецепторов
1.3.3.2. Сигнальные каскады рецептора р7э
1.3.3.3. Взаимодействие каскадов, запускаемых рецепторами Trk и р75
1.3.3.4. Участие сортилина в сортировке
и сигнализации нейротрофических факторов
1.4. Проноследовательности нейротрофинов
1.4.1. Роль пропоследовательностей в фолдинге нейротрофинов
1.5. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Общие методы
2.2.1. Культивирование микроорганизмов
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот
2.2.4. Трансформация клеток Escherichia coli
штаммов XL-1 (blue) и BL-21 (DE3-X)
2.2.5. Полимеразная цепная реакция
2.2.6. Обработка продуктов ПЦР лолинуклеотидкиназой
2.2.7. Секвенирование нуклеотидных последовательностей
2.2.8. Электрофоретический анализ белков
2.2.9. Осаждение белков трихлоруксусной кислотой
2.2.10. Количественное определение белка
2.2.11 Статистический анализ данных
2.3. Конструирование плазмид pUC19_NGF и pUC19_BDNF,
несущих гены нейротрофинов NGF и BDNF человека
2.4. Конструирование рекомбинантных продуцентов
различных вариантов нейротрофинов

2.5. Анализ динамики накопления целевых белков
в клетках-ZT. coli BL-21, несущих экснрессионные плазмиды
2.6. Выделение целевых белков из клеток штамма-продуцента
2.7. Очистка целевых белков с использованием
металл-хелат аффинной хроматографии на Ni-HTK-агарозе
2.8. Фолдинг рекомбинантных белков
2.8.1. Фолдинг индивидуального NGF в присутствии
не связанного ковалентно пропептида (фолдинг в системе in trans)
2.9. Анализ олигомерной организации свернутых белков
2.10. Ограниченный протеолиз рекомбинантного предшественника NGF
2.11. Оценка биологической активности рекомбинантных нейротрофинов
2.11.1. Анализ дифференцирующего действия различных вариантов NGF
на клетки феохромоцитомы крысы линии РС12
2.11.2. Исследование влияния proNGF
на выживаемость клеток феохромоцитомы крысы PC
2.11.3. Анализ пролиферативного действия разных вариантов NGF
на клетки эритролейкемии человека TF
2.11.4. Оценка выживаемости клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2 и глиобластомы человека линии U373MG
под действием рекомбинантного нейротрофина BDNF
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование рекомбинантных продуцентов
нейротрофинов человека
3.1.1. Клонирование генов нейротрофинов NGF и BDNF человека
3.1.2. Конструирование рекомбинантных штаммов-продуцентов
различных вариантов нейротрофинов NGF и BDNF человека
3.2. Получение различных вариантов
нейротрофинов NGF и BDNF человека
3.2.1. Биосинтез целевых белков в клетках E. coli BL
3.2.2. Получение высокоочнщенных препаратов
различных вариантов нейротрофинов NGF и BDNF человека
3.3. Фолдинг рекомбинантных ненротрофических факторов
NGF и BDNF человека

um j

Cys-богатый
домен
Leu-богагый
мотив
Им муиотобулип-
подобный
домен
Трансмембранный
домен
ТирозинкиназшЛ!
домен
Рис. 1-9. Схематическое представление рецептора семейства Trk. Буквами Dl -D5 справа от схемы указаны домены внеклеточной области. Слева от структуры подписаны сокращения данных доменов: Dl, D3 - цистеин-богатые домены (CRD), D2 — лейцин-богатый домен (LRD); максимальное количество лейцин-богатых мотивов в домене - 3; D4. D5 - иммуноглобулин-подобные домены (Ig-C1 и tg-С2), Рис. 1-9 взят из [87] с изменениями.
Внеклеточная область отвечает за связывание и распознавание лиганда. Она состоит из двух цистеин-богатых доменов (D1 и D3, или CRD). между которыми заключен второй домен (D2, или LRD), состоящий из трех лейцин-богатых мотивов. Далее следуют два иммуноглобулин-подобных домена С2-типа (D4 и D5, или Ig-Cl и Ig-C2), причем за связывание с нейротрофинами отвечает именно D5 [70, 71] (Рис. 1-9).
Внутри упомянутых пяти доменов внеклеточной области содержится несколько сайтов N-гликозилирования. Например, TrkA рецептор содержит 13 таких сайтов [93, 94]. Показано, что гликозилирование выполняет, по меньшей мере, две функции -предотвращает лигнад-независимую активацию рецептора, а также определяет локализацию рецептора на клеточной мембране. Ингибирование гликозилирования приводит к накоплению Trk внутри клетки и индуцирует конститутивную активацию тирозинкиназы в отсутствие лиганда [95, 96].
Трансмембранный домен служит своеобразным якорем, фиксирующим рецептор на цитоплазматической мембране.
Внутриклеточный регион состоит из тирозинкиназного домена и короткой карбокси-концевой аминокислотной последовательности. Тирозинкиназный домен является необходимым для инициации сигнала и дальнейшей его передачи [87]. При связывании лиганда с рецептором происходит фосфорилирование его внутриклеточного домена по нескольким остаткам тирозина, что приводит к активации различных сигнальных каскадов, которые будут рассмотрены ниже (Раздел 1.3.3.).
Для TrkB и ТгкС известны изоформы с укороченными внутриклеточными доменами. Отмечено, что они экспрессируются преимущественно клетками глии. Например, было