Гидроксилирование 3-кетостероидов прегнанового и андростанового ряда мицелиальными грибами Curvularia lunata и Gongronella butleri

• Автор: Коллеров, Вячеслав Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 131 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Микробиологическое гидроксилирование стероидов андростанового и прегнанового ряда
2.1.1. Распространенность Зкетостероид ргидроксилазноЙ активности среди микроорганизмов

2.1.2. Свойства ргидроксилазы

2.1.3. Механизм действия цитохромР0монооксигеназы

2.2. Проявление субстратной специфичности при микробиологическом гидрокенлировании 3кетостероидов
2.3. Влияние условий культивирования на морфофизиологическис особенности мицелнальных грибов

2.4. Особенности нротопластированпя и мутагенеза мицслиапьных грибов

2.5. Гидроксилирование стероидных соединений растущим и отмытым мицелием

2.6. Биоконвсрсия стероидных субстратов

2.6.1. Конверсии стероидных субстратов в микрокристаллической форме
2.6.2. Использование органических растворителей
2.6.3. Использование циклодекстринов и их производных
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Культивирование vi 4
3.1.3. Культивирование i
3.1.4. Получение внутриклегочных фракций дезинтегрированного мицелия С. и i
3.1.5. Протопластирование С.
3.1.6. Мутагенез С.
3.1.7. Трансформация стероидных субстратов С. и . i
3.1.8. Световая и электронная микроскопия
3.1.9. Аналитические методы
3.1.9.1. тех
3.1.9.2. Колоночная хроматография
3.1.9.3. вэжх
3.1.9.4. Массспектрометрическнй анализ
3.1.9.5. Спектры ЯМР 1Н
3.1.9.6. Определение концентрации белка
3.1.9.7. Определение растворимости стероидов
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.2.1. Скрининг мицелнальных грибов на наличие Ргидроксилазной активности в отношении ФМДКА
3.2.2. Трансформация ФМДКА культурами С. и . i
3.2.2.1. Анализ продуктов трансформации ФМДКА
3.2.3. Влияние условий трансформации на ргидроксилазную активность отмытого мицелия С. при конверсии ФМДКА
3.2.3.1. Особенности процесса 1 iгидроксилирования ФМДКА в присутствии циклодекстрина, метанола и феназнн метасульфата
3.2.3.2. Влияние индукторов на Ргидроксилазную активность С.
3.2.4. Определение локализации стсроидтрансформируюших ферментов
С. i и . i
Оптимизация процесса трансформации ФМДКЛ культурой . i
Выбор состава питательной среды для выращивания мицелия . i
Влияние различных способов внесения субстрата ФМДКА в среду трансформации на степень его биоеконверсии и выход 0гидроксипроизводных
Зависимость проявления 1 гидроксилазнои активности . i в отношении ФМДКА от количества биомассы мицелия Гидроксилированис стероидов андростанового ряда культурами С. и . i
Трансформация АД, АДД и 9аОН АД культурой . i Трансформация АД, АДД и 9осОН АД культурой С. Биоконверсия кортексолона и его ацетилированных производных
культурой С.
Биоконверсия кортексолона и его ацетилированных производных культурой . i
Протопластированне С. и получение мутантных штаммов с
повышенной ргидрокенлазной активностью
Оптимизация процесса трансформации ,диацстата
кортексолона мутантным штаммом С. М
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЕ акт испытаний способа микробиологического 0гидроксилирования сх, диацетата прегн4ен а, диол3,диона клетками vi ВКМ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АД андрост4ен3,дион А ДД ан дрост1,4д иен3,дион
ГМПгидроксиметилпрегн4ен3он, гидроксиметилпрогестерон
ДГЭА Зргидрокси5андростен он, дегидроэпиадростерон
9аОНАД 9агидроксиандрост4ен3,дион
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ДМСО диметилсульфоксид
ДМФ диметилформамид
МС массспектрометрия
МЦЦ метилированное производное 3циклодекстрина
НАДФН никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
НГ нитрозогуанидин
ПАВ поверхностно активное вещество
Т ргидрокси4андростен 3он, тестостерон
ТСХ тонкослойная хроматография
ФМС феназинметасульфат
ФМДКА ацетатбафтор1 баметилдезоксикортикостерона ФМДК 6афтораметилдезоксикортикостсрон ФМКА ацетатбафтор аметилкортикостерон ФМК 6афтораметилкортикостерон
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Разработай не имеющий аналогов метод получения 6афтор1баметил1 гидроксикортикостерона на основе трансформации ацетата 6афтор1баметилдезоксикортикостерона культурой . Метод обеспечивает мольный выход кристаллического целевого стероида не ниже при высокой 8 гл нагрузке субстрата. Предложен способ получения гидрокортизона из а,диацетата кортексолона с использованием мугаитного штамма vi М4 и выходом 1 гидроксипроизводиых более при нагрузке субстрата гл. Полученные в работе штаммы и разработанные с их использованием биотехнологические методы могут быть применены при производстве современных гидроксистероидов с ценными терапевтическими свойствами. Результаты исследований по локализации стероид грансформирующих активностей культур . Изучение процессов биоконверсии замещенных стероидов андростанового ряда исследуемыми культурами расширило представление о метаболизме стероидов мицелиальными грибами и позволило получить продукты трансформации, которые могут быть использованы для производства высокоактивных фармакологических стероидных препаратов. Разработаны оригинальные процедуры протопластирования, мутагенеза и селекции грибной культуры С. Методы могут быть использованы для получения мутантных штаммов других мицелиальиых грибов с целевой стероидтрансформирующсй активностью. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях на 9й и ой Путинских конференциях молодых ученых , г. Наука. Бизнес. Образование Пущино. Биотехнология Пущино, г. Актуальные аспекты современной микробиологии, Москва, г. ИБФМ РАН г. Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья и 8 тезисов. Структура и объм диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа содержит 1 страницу машинописного текста, таблицы и рисунков. Библио1рафия включает 8 наименований, из них 9 иностранных работ. Для производства стероидных соединений с терапевтическим эффектом необходимы высокоспецифические реакции. Сложность стероидной молекулы делает использование микроорганизмовбнокатализаторов особенно актуальным вследствие высокой регио и стерео селективности проводимых ими реакций. Выбор эффективного штаммабиокатализатора и оптимальных условий биоконверсии может приводить к высоким показателям биологических процессов , . Гидроксилирование является одной из ключевых реакций метаболизма стероидов микроорганизмами, широко используемой в биоконверсии стероидов Ахрсм, . При е осуществлении традиционно основная роль отводится мицелиальным грибам, которые проводят процесс более эффективно, чем другие микроорганизмы i . Наибольший интерес представляют реакции гидроксилирования по положениям а и Р, 7 а и Р, 6 а и Р, 9 а, а и Р, а и р, приводящие к образованию физиологически активных гидроксипроизводных стероидов , , v . Шувалова с соавт. I . Стероидные молекулы с введенными гидроксильными группами в положениях а, i, а и а являются наиболее ценными для индустрии производства проппювоспалительных лекарств . К настоящему времени гидроксилирующая активность по отношению к стероидам андростанового ряда исследована у грибов различной таксономической принадлежности. Сведения, в основном, касаются биоконверсии таких стероидов, как андрост4ен3,дион АД, андрост,4диен3,дион АДД, андрост4енрол3он тестостерон, а также их различных производных рис. Шувалова с соавт. Наиболее часто встречающимися реакциями при трансформации АД являются а, 7а, На, а, бргидроксилирование, а также дегидрирование и рвосстановление Xi . Конверсия АДД микроорганизмами сопровождается, как правило, гидроксилированием но положению а и а, рвосстаиовлением и 1,2гидрированием с образованием АД Войшвилло с соавт.