Бесприборная иммунодиагностика инфекционных заболеваний на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров

• Автор: Полтавченко, Александр Георгиевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 311 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ПРИМЕНЕНИЕ ТВЕРДОФАЗНЫХ МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Обзор
литературы.

1.1. Общие принципы классификации иммунохимичсских методов

1.1.1. Основные принципы иммунохимичсского анализа.

1.1.2. Гипы образцов для иммунохимического анализа

1.1.3. Характеристики реагентов, используемых в иммуноанализе

1.1.4. Системы разделения реагентов, связавшихся и несвязавшихся в ходе иммунологической реакции

1.1.5. Системы дегекции результатов иммунологического взаимодействия.

1.1.5.1. Инструментальные методы детекции иммунологического связывания.

1.1.5.2. Методы детекции результатов иммуноанализа с применением меченых биозондов.

1.1.6. Форматы твердофазных иммунохимичсских тестов
1.1.6.1. Тесты, выполняемые в планшетах для иммунологических реакций.
1.1.6.2. Иммунохимические тесты, выполняемые на плоских подложках
1.1.6.3. Быстрые иммунохимические тесты, основанные на фильтрации
1.1.6.4. Иммунохимический анализ, выполняемый с
применением микрочастиц
1.1.6.5. Иммунохимический анализ, выполняемый на белковых . матрицах.
1.1.6.6. Иммуносенсоры
1.2. Методы оценки результатов иммунодиагностических тестов
1.3. Стратегии применения иммунодиагностических тестов.
1.3.1. Иммунодиагностическое обследование в специализированных клинических лабораториях
1.3.2. Иммунодиагностическое обследование, выполняемое в слабооснащенных медицинских учреждениях
1.3.3. Иммунодиагностическое обследование в кабинете врача и на дому.
1.3.4. Специфическая индикация биологических угроз.
1.4. Подходы к разработке новых иммунодиагностических тестов.
1.5. Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава 3. РАЗРАБОТКА ПЛАНШЕТНОГО ВАРИАНТА ИММУИОАНАЛИЗА С ВИЗУАЛЬНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТА ТОВ НА ОСНОВЕ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ ЗОЛЕЙ КАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТАЛЛОВ
3.1. Предпосылки создания иммунокаталитического теста
3.2. Железосодержащие золи.
3.2.1. Получение железосодержащих золей
3.2.2. Оценка эффективности применения железосодержащих золей.
3.3. Золи серебра
3.3.1. Получение серебряных золей и исследование их структурнодисперсных характеристик.
3.3.2. Стабилизация серебряных золей.
3.3.3. Проявление серебряных золей.
3.3.4. Оценка эффективности применения серебряных золей
3.4. Кобальтсодержащие золи
3.4.1. Получение и свойства кобальтсодержащих иммунозолей
3.4.2. Проявление кобальтсодержаших иммунозолей
3.4.3. Оптимизация условий проведения анализа
3.4.4. Оценка эффективности применения кобальтсодержащих золей
Глава 4. РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БЫСТРЫХ И ПРОСТЫХ ТЕСТОВ НА ПОРИСТЫХ ПОДЛОЖКАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ КОРПУСКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ.
4.1. Экспрессное иммунофильтрационное выявление антител и антигенов
вируса Эбола с применением иммунозолей золота и усиления сигнала физическим проявлением.
4.1.1. Задачи и условия экспериментов
4.1.2. Иммунофильтрационное выявление антител
4.1.3. Иммунофильтрационное выявление антигена.
4.2. Прямое выявление антигенов iii в дотиммуноанализе на белковых матрицах с обратной фазой с применением иммунозолей
серебра
4.3. Прямое выявление специфических антител в дотиммуноанализе с применением иммуносуспензий на основе углеродных маркеров
4.3.1. Задачи и условия экспериментов
4.3.2. Выявление антител к вирусу паротита с использованием маркеров на основе активированного угля и графитированной
4.3.3. Выявление противобруцеллезных антител в сыворотке крови экспериментальных животных с использованием маркеров па основе активированного угля.
4.3.4. Выявление антител к i с использованием маркеров на основе норита
4.3.5. Выявление биотинилированных белков с применением
маркеров на основе угля, импрегнированного серебром
4.3.6. Сравнение чувствительности выявления I в ИФА и дотиммуноанализе с использованием маркеров на основе коллоидного золота, активированного угля и угля, импрегнированного серебром.
Глава 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К КОНСТРУИРОВАНИЮ И ПРИМЕНЕНИЮ БЕЛКОВЫХ МАТРИЦ ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КАТАЛИТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
5.1. Предпосылки создания многопрофильною теста и постановка задачи
5.2. Выбор формата многопрофильного теста
5.3. Многопрофильный анализ антигенов.
5.4. Многопрофильное выявление антител
5.4.1. Выбор и исследование свойств материалов для подложки
5.4.2. Отработка способов подготовки поверхности подложки
5.4.3. Подбор антигенов для изготовления матрицы
5.4.4. Выбор способа и условий иммобилизации антигенов на подложке
5.4.5. Отработка автоматизированного способа нанесения антигенов.
5.4.6. Выбор системы детекции.
5.4.7. Оптимизация состава и условий применения физического проявителя
5.4.8. Оптимизация условий выполнения многопрофильного анализа
5.4.9. Испытания лабораторного образна теста для многопрофильного анализа антител.
5.4 Разработка средств инструментального учета результатов теста
5.4 Разработка прототипа набора реагентов для многопрофильного анализа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Литература


Вспомогательные компоненты могут иметь большое значение при выявлении состоявшегося события иммунологического связывания, но бесполезны в x случаях, когда эго событие не состоялось или произошло неудачно. Часто в качестве реагента детекции в иммуноанализе используются протеины А и , выделенные из i , i . Эти белки обладают свойством прочно связываться с фрагментом I, не препятствуя специфическому иммунному взаимодействию фрагментов с антигеном. Эти реагенты дешевле, чем антивидовые антитела, и широко используются в различных форматах иммуноанализа 8. При иммобилизации этих белков на макроносителях можно производить высокоэффективную очистку иммуноглобулинов и даже фракционировать поскольку их способность связываться с разными классами и подклассами иммуноглобулинов различна 0. Из других реагентов, часто использующихся в иммунологическом анализе, необходимо отмстить биотин, авидин и стрсптавидин. Гликопротсин яичного белка авндин и позднее выделенный из бактерий Зкериткеи аг1сИпИ стрсптавидин обладают способностью к избирательному и исключительно прочному Кп 1 М связыванию биотина витамина Н, причем для установления связи необходимо только уреидное кольцо витамина . Карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотииилированные производные. Молекула авидина включает в себя четыре идентичные субъединицы и может одновременно связаться с двумя различными биотинилированными молекулами белка например, антитела и фермента 7. Применение авидинбиотиновой системы ограничивается высокой основностью авидина изоэлектрическая точка р ,5 и наличием в его молекуле углеводных остатков, что обуславливаег высокий уровень иеспецифического связывания . Хотя неспецифические взаимодействия авидина можно свести к минимуму с помощью химических или других методов, наилучшим решением этой проблемы является применение стрсггтавидина и его конъюгатов 2. Подобно авидину, стрептавидин также является теграмером и содержит четыре биотиисвязываюгцих центра. Однако, поскольку он не гликозилирован и имеет нейтральную изоэлектрическую точку р1 6,5, то у пего мснес выражена склонность к неспецифическим взаимодействиям, свойственная авидину . Стрептавидин и его разнообразные конъюгаты коммерчески доступны, хотя и стоят несколько дороже, чем их авидиновые аналоги. Свойства авидин стрептавидин биотинового комплекса широко используются для решения различных задач, в частности для повышения эффективности иммобилизации реагентов захвата на твердой фазе, а также для каскадных систем усиления иммунологического сигнала 2. В настоящее время наиболее распространены твердофазные методы иммуноанализа, поскольку они позволяют существенно упростить проведение анализа и уменьшить фоновый сигнал . Такие методы, характеризуются высокой чувствительностью и скоростью получения результата. Эти качества, а также удобство и простота постановки гесгов на твердой фазе обеспечили их широкое внедрение в медицине, ветеринарии, науке и производстве . Анализ доступной информации о мировом рынке иммунодиагностических наборов позволяет сделать вывод о том. Сущность твердофазного иммуноанализа заключается в иммобилизации какимлибо способом антигена или антител па плотной фазе планшете, матрице, подложке с последующей обработкой меченым, специфическим к определяемому аналиту иммунореагентом соответственно, антителами или антигенами и, после отмывки несвязавшегося реагента, выявлении оставшейся на матрице метки маркера. Но способу выделения анализируемого вещества из образца различают прямой сорбционный вариант когда выделение и иммобилизацию на матрице осуществляют физической адсорбцией аналита из раствора 5, и сэндвичвариант когда иммобилизация осущест вляется за счет взаимодействия аналита с первичным иммунореагентом, предварительно связанным с матрицей 1. Сэндвичвариант позволяет селективно выделять из образца и концентрировать определяемое вещество на матрице. Он предпочтительней при низком содержании определяемого вещества в пробе или значительном содержании в ней конкурирующих за сайты адсорбции примесей .