Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности

• Автор: Киселев, Константин Вадимович
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 91 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Криокоассрвировапие сохранение биологического материала при помощи сверхнизких температур.

1.1.1 Развитие методов криоконсервирования.

1.1.2. Классификация криопротекгоров.

1.1.3. Естественные способы устойчивости к низким температурам

и криопротекторы.

1.1.4. Криоконсервация морских животных

1.1.5. Криопротекторы на основе липидов

1.1.6. Жизнеспособность, целостность и функциональная активность
в популяции клеток после замораживанияоттаивания
1.2. Культуры клеток в морской биотехнологии
1.2.1. Продукция биологическиактивных веществ в культуре клеток .
1.2.2 Культуры клешк морских беспозвоночных
1.2.3. Увеличение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных с помощью белковых активаторов
1.2.3.1. Факторы роста морских ежей.
1.2.3.2. Новый подход для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных
1.2.3.3. ва представитель универсальных
активаторов транскрипции эукариотических генов.
1.2.3.4. Возможность цисрегуляции гена ЭРФ морских ежей белком Оа.
1.3. Перенос экзогенной ДНК в морской биотехнологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2. МАТЕРИАЛЫ
2.1. Животные
2.2. Плазмиды
3. МЕТОДЫ.
3.1. Приготовление препаратов липидов
3.2. Замораживание клеточной суспензии.
3.3. Оттаивание клеточных культур.
3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия липидов.
3.5. Трансфекция эмбрионов морских ежей.
3.6. Получение первичных культур из клеток морских беспозвоночных
3.7. Фракционирование суспензии эмбриональных клеток морских ежей . .
3.8. Трансфекция первичных клеточных культур, полученных из эмбрионов морских ежей со стадии бластулы.
3.9. Выделение тотальной ДНК из эмбриональных клеток морских ежей .
3 Полимеразная цепная реакция ПЦР с использованием тотальной ДНК, выделенной из эмбриональных клеток морских ежей.
3 Выделение тотальной РНК из эмбрионов морских ежей и ее очистка . . .
3 Получение фракции матричной РНК.
3 ОТПЦР анализ
3 Рестрикционный анализ продуктов амплификации
3 Включение Н3тимидина.
3 Включение Суридина.
3 Фотосъемка
3 Приготовление полутонких срезов.
3 Выделение и определение содержания нафтохиноновых
пигментов из клеток первичных культур морского ежа.
Яь 3 Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Эмбриональное развитие морского ежа и мидии.
4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток
морских беспозвоночных.
4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после
замораживанияоттаивания
4.2.2. Уровень синтеза РНК в первичных культурах личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток
морских ежей после замораживанияоттаивания
4.2.3. Температуры фазовых переходов общих липидных
экстрактов морских беспозвоночных.
4.2.4. Особенности замораживанияоттаивания клеток морских беспозвоночных.
4.3. Влияние активатора транскрипции а4 на рост и развитие
эмбрионов и эмбриона1ышх клеток морских ежей.
4.3.1. Трансфекция оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов
морских ежей геном
4.3.2. Детекция генов, гомологичных генам цитоплазматических актинов СуПЬ и СуШЬ морского ежа 5. ригригаШя в клетках морских ежей
при помощи геноснсцифичсской ПЦР
4.3.3. Детекция гена 4 в эмбриональных клетках морских ежей
при помощи I еноспецифической ПЦР
4.3.4. Экспрессия гена, гомологичного гену цитоплазматического
актина СуПЬ 5. ригригаш в клетках плоского морского ежа.
4.3.5. Доказательство экспрессии гена
4.3.6. Рестрикционный анализ продуктов амплификации
4.3.7. Количество эмбрионов с ОПС у разных видов морских ежей .
4.3.8. Количество эмбрионов с окрашенными ОПС у разных видов
морских ежей.
4.3.9. Образование ОПС в процессе культивирования эмбрионов
морских ежей.
4.3 Влияние количества плазмидной ДНК на образование
эмбрионов с ОПС у морских ежей.
4.4. Очистка эмбриональных клеток морских ежей фракционированием
в ступенчатом градиенте плотности перколла
4.5. Влияние ингибиторов киназ и фосфотаз на развитие эмбрионов
морских ежей
4.6. Пролиферативная активность клеток морских ежей,
трансформированных геном 4.
4.6.1. Трансфекция первичных клеточных культур морских ежей
геном 4.
4.6.2. Клеточные культуры, полученные из трансфецированных
геном а эмбрионов морских ежей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


За последние лет было описано более химических соединений из морских организмов, причем многие из этих природных биоактивных метаболитов обладают высоким фармакологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспозвоночные, которые представляют собой источник ценных биологически активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных организмах I . В частности плоский морской еж i iii содержит нафтохипоидные пигменты, главным из которых является эхинохром iii, . Препарат Гистохром, созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими свойствами Еляков и др. Мищенко и др. Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заманчиво разработать технологии промышленного культивирования клеток этих животных с целью получения биологически активных веществ. Продукция биологически активных веществ i vi может стать альтернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии, что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследования, получено лишь две культуры из тканей морских беспозвоночных и низших позвоночных из тканей кораллов . Низкая пролиферативная активность клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. Проблему получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференцирован, изменив экспрессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность дальнейших широких и углубленных исследований особенностей культивирования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений. Наиболее перспективным источником получения делящихся клеток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интенсивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного источника клеток этих животных. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимулировать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изменение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использовали транскрипционный активатор транскрипции, ген 4. Разработать методы криоконсервации клеточных культур морских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекгоров. Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания в присутствии разных криопротекгоров. Найти эффективный способ переноса чужеродных генов в клетки морских ежей. Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экспрессию в них гена активатора транскрипции 4. Исследовать влияние гена 4 на эмбриональное развитие морских ежей и пролиферативную активность клеток в первичных культурах. Разработан метод криоконсервации морских беспозвоночных, при использовании которого жизнеспособность клеток составляет для морских ежей и для мидии. Осуществлен перенос гена 4 в эмбрионы морских ежей и показано, что ген эффективно в них экспрессируется. Экспрессия гена 4 в эмбриональных клешах морских ежей приводит к дедифференциации клеток и увеличивает их пролиферативную активность. Предложен новый для морской биотехнологии способ увеличения пролиферативной активности клеток, заключающийся в использовании геновактиваторов транскрипции. Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ДВГУ, а также в группе биоинжеперии Биологопочвенного института ДВО РАН. Выделение липидных экстрактов и анализ температур их фазовых переходов были проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета профессором д. Э.Я. Костецким и доцентом к. Н.М. Саииной.