Изучение аффинных свойств поверхностного рецепторного белка стрептококка группы G методом высокоэффективной монолитной хроматографии

• Автор: Ложкина, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23, 02.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 157 с. : ил

Введение

1. Обзор литературы

1.1 я vi построение биологических процессов с участием иммобилизованных систем и их использование в биоанализе и биопревращениях

1.1.1 Понятие биологического моделирования.

1.1.2 Статические и динамические методы биоанализа и биоконверсии, основанные на принципе аффинности

1.1.2.1 Биологические тестсистемы.

1.1.2.2 Аффинная хроматография.

1.1.2.3 Проточные биореакторы на основе иммобилизованных

ферментов и клеток.

1.2 Монолитные макропористые среды для реализации динамических процессов межфазового переноса в системах, основанных на аффинных взаимодействиях

1.2.1 Общие представления о ГМАЭДМА макропористых монолитах

и о высокоэффективной монолитной хроматографии.
1.2.2 Гидродинамические особенности монолитных ГМАЭДМА сорбентов
1.2.3 Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография ВЭМДАХ.
1.2.4 Применение аффинной хроматографии для количественной
оценки специфического комплексообразования.
1.2.5 Проточные реакторы непрерывного действия на основе
иммобилизованных ферментов.
1.3 Взаимодействие стрептококков группы с белками плазмы крови
1.3.1 Основные сведения о стрептококках
1.3.2 Иммуноглобулин структура и функции
1.3.3 Альбумин структура и функции.
1.3.4 Стрептококковый белок в.
2. Результата и обсуждение.
2.1 Исследование аффинных свойств рекомбинантного белка С методом ВЭМДХ.
2.1.1 Иммобилизация белковлигандов на С1М дисках
2.1.2 Сравнение количественных параметров взаимодействия моно и бифункциональных форм рекомбинантного белка в с и С А
2.1.3 Изучение структуры бифункционального белка в
2.2 Конструирование эффективных проточных систем на основе иммобилизованных биологических надмолекулярных структур.
2.2.1 Вопрос соответствия морфологии ГМАЭДМА монолитов размеру микроорганизмов.
2.2.2 Монодисперсные полимерные микросферы как структурные имитаторы клеток
2.2.2.1 Выбор морфологии ГМАЭДМА носителей с точки зрения их проницаемости для суспензий монодисперсных полимерных латексов
2.2.2.2 Создание искусственных клеток имитаторов стрептококка
на основе функционализированных ПММА латексных частиц.
2.2.2.3 Оценка эффективности модельной функциональной системы
2.2.3 Создание и исследование проточных систем на основе иммобилизованных на ГМАЭДМА монолитах стрептококков
группы в
2.2.3.1 Оптимизация условий ковалентной иммобилизации клеточных структур
2.2.3.2 Оценка рецепторной активности иммобилизованных клеток стрептококка
2.3 Приложения скоростное аффинное выделение белков из биологических жидкостей.
2.3.1 Фракционирование плазмы крови с одновременным извлечением иммуноглобулина О и сывороточного альбумина.
2.3.2 ГТолупрспаратиспсе выделение дО и ппяиш крови человека с использованием радиальной С1М колонки
2.3.3 Анализ качества выделенных продуктов иммуноглобулина С и сывороточного альбумина
2.3.4 Исследование влияния скорости потока подвижной фазы на эффективность выделения белка О из клеточных лизатов
2.3.5 Влияние температуры на адсорбционную емкость сорбента
2.3.6 Эксплуатационные характеристики аффинных С1М сорбентов
2.4 Непроточные комбинированные монолитные слои
2.4.1 Изготовление композиционных слоев макропористые
монолиты на стеклянной основе
2.4.2 Примеры применения комбинированных пластин в биоанализе
3. Экспериментальная часть.
3.1 Материалы и приборы
3.2 Методы.
3.2.1 Определение проницаемости ГМАЭДМА сорбентов.
3.2.2 Изготовление модельных клеток стрептококка путем химической функционализации ПММА микросфер белком в
3.2.3 Иммобилизация биологических объектов на ГМАЭДМА носителях
3.2.4 Высокоэффективная монолитная дисковая
аффинная хроматография ВЭМДАХ
3.2.5 Оценка активности иммобилизованных клеток стрептококка методом ВЭМДАХ с флуориметрическим детектированием.
3.2.6 Определение числа клеток стрептококка, иммобилизованных
на С1М сорбенте.
3.2.7 Иммуноферментный твердофазный анализ.
3.2.8 Определение белков в исходных биологических жидкостях
методом иммуноблоттинга.
3.2.9 Методы лизиса клеток микроорганизмов
а Л л ръттг ч ГУЛ
.i. 1 и иыдслсппс ипили ППЧГЧЛМ О.А. ШЛ
сложных биологических жидкостей методом аффинной ВЭМХ.
3.2. Контроль чистоты выделенных белков методом гельэлектрофореза.
3.2. Синтез ГМАЭДМА монолитов с заданным размером пор
3.2. Изготовление плоских композиционных слоев на основе полимерного ГМАЭДМА монолита и стекла
3.2. Аффинные тестсистемы на основе комбинированных слоев
Список литературы.
Приложения
Благодарности.
Список используемых в тексте сокращений
ГМАЭДМА Сополимер глицидилметакрилата 2,
ппксигтпппилметакпилата и
этиленгликольдиметакрилата ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭМХ Высокоэффективная монолитная хроматография
ВЭМДХ Высокоэффективная монолитная дисковая
хроматография
ИФТФА Иммуноферментный твердофазный анализ
СА Сывороточный альбумин
I Иммуноглобулин
. i ii i
II.ф. Подвижная фаза
Фосфатный буфер с добавлением хлорида натрия
Фосфатный буфер с добавлением хлорида натрия и
КДИ Карбодиимид
Константа диссоциации аффинного комплекса x Экспериментальная адсорбционная емкость
аффинного сорбента ix Теоретическая максимальная адсорбционная
емкость аффинного сорбента vx Экспериментальная мольная адсорбционная емкость
аффинного сорбента vix Теоретическая максимальная мольная
адсорбционная емкость аффинного сорбента Время пребывания растворенног о соединения
внутри морового пространства Время, необходимое молекуле для диффузионного
Белок О
микросферы


преодоления расстояния от ее местонахождения до адсорбционного центра лиганда Ппирпуностный петтептопный белок стоептококков
Среда для культивирования . i Полиметилметакриатные микросферы
Полиметилметакриатные микросферы, стабилизированные дексграном додецилсульфат натрия Биологически активное вещество Относительное стандартное отклонение
Введение


Методом высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии определены количественные параметры аффинного взаимодействия белка О с иммуноглобулином О и сывороточным альбумином. Впервые обоснована эффективность привлечения модельных клетокимитаторов для оптимизации условий иммобилизации надмолекулярных структур на макропористых ГМАЭДМА монолитных сорбентах. Впервые разработаны подходы для создания проточных функциональных систем с участием микроорганизмов стрептококков группы О, иммобилизованных на метакоилатных макропористых носителях. Впервые предложены непроточные комбинированные пластины на основе инертного материала стекла и ковалентно связанного с ним слоя ГМАЭДМА монолита, предназначенные для использования в диагностике. Практическая значимость. Разработаны и оптимизированы лабораторные схемы скоростного выделения рекомбинантных форм белка иммуноглобулина О и сывороточного альбумина высокой степени чистоты из нативных биологических жидкостей методом высокоэффективной монолитной дисковой аффинной хроматографии. Предложена методика нолупрепаративного выделения с привлечением ГМАЭДМА монолитных радиальных колонок. Осуществлено фракционирование плазмы крови человека с одновременным извлечением и СА, используя метод ВЭМДХ. Термин моделирование подразумевает упрощенное построение какихлибо объектов или процессов, основанное на их подобии существующим объектам или процессам. Таким образом, моделирование может использоваться как метод исследования различных систем путем построения и изучения их моделей, отличающихся от объектов моделирования масштабами или физической природой протекающих в них явлений, но достаточно точно адекватно отображающих представляющие интерес свойства этих объектов 1. Основные принципы физического и математического моделирования применимы к биологическим системам 2. Создание биологических моделей представляет собой i vi построение искусственных систем, имитирующих явления, происходящие i viv при этом в качестве переменных рассматриваются различные условия и факторы, способные оказывать влияние на эти процессы, а адекватность модели оценивается по активности протекающих биологических превращений. Биологические события могут быть смоделированы на различных уровнях организации живой природы, а именно 1 молекулярногенетическом , 2 субклеточном органоиды клеток и клеточном , а также 3 надклеточном искусственные ткани и органы . Исследование путем моделирования биохимических превращений первых двух уровней позволяет предсказывать поведение более высокоорганизованных природных процессов 2. ДНК и и т перечисленные процессы основаны на уникальном свойстве биологического распознавания, происходящего через образование обратимодиссоциирующих высокоспецифических или биоаффинных комплексов соответствующих природных партнеров 9. Подход биологического моделирования позволяет выделить одно биохимическое событие например, взаимодействие рецепторлиганд, ферментсубстрат, ДНКРНК из совокупности явлений, одновременно происходящих i viv, воссоздавая и исследуя его i vi 2. При сравнении свойств БАВ i viv, т. Это касается таких свойств, как чувствительность к ингибиторам, функциональная специфичность, оптимум и др. Очевидно, что разрушение клетки и последовательный переход от субклеточных форм к их отдельным элементам приводит к нарушению структурной организации естественных биореакторов, что сопровождается повреждением их регуляционного аппарата . Кроме того, необходимо учитывать, что в условиях функционирования клетки большинство биохимических процессов происходит на границе раздела фаз одни вещества связаны с внутренними или внешними структурными компонентами клетки, а соответствующие им комплементы, как правило, находятся во внутри или внеклеточной жидкости. Таким образом, знание точных характеристик и механизмов действия биологически активных веществ в растворе часто оказывается недостаточным для однозначного описания их поведения и физиологической роли в клетке. В связи с вышесказанным считается, что наиболее перспективным подходом является построение так называемых гшмобилизационных моделей биологических структур 2.