Рекомбинантный антиген эхинококка EgF : Получение и свойства

• Автор: Одоевская, Ирина Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.19
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение.

1. Обзор литерату ры.

1.1. Биологические и морфологические особенности эхинококка

1.2. Антигенный состав эхинококка

1.3. Иммодиагностика ларвального гидатидоза

1.4. Особенности строения генома эхинококка

1.5. Использование методов молекулярной биологии для оптимизации экспрессии клонированных генов.

1.5.1. Амплификация генов в составе рекомбинантных плазмид.

1.5.2. Конструирование генов гибридных белков как метод оптимизации трансляции

1.5.3. Стабилизация мРНК чужеродного гена

1.5.4. Стабилизация чужеродных белков в Е.соП
1.5.5. Применение методов генной инженерии в гельминтологии
1.5.6. Генноинженерные антигены в диагностике и вакцинопрофилактике цистных гидатидозов
2.Собствснные исследования.
2.1. Материалы.
2.2. Используемые реактивы.
2.3. Методы исследований.
2.3.1. Выделение геномной ДНК ЕгапЫоэиз из протосколексов паразита.
2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага Аи
2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном гелс
2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды
2.3.6. Проведение ДНК ДНК гибридизации
2.3.7. Амплификация гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными ол иго нуклеотидными праймерами.
2.3.8. Лигирование плазмидной векторной ДНК с фрагментом эукариотического гена
2.3.9. Проведение реакции трансформации
2.3 Скрининг рекомбинантных клонов.
2.3 Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой.
2.3 Электрофорез в денатурирующих условиях.
2.3 Электроперенос.
2.3 Постановка иммуноферментной реакции
2.3 Иммунное выявление антигенов на фильтре
2.3 Изучение лротективных свойств рекомбинантного антигена
3. Результаты исследований
3.1. Наработка препаративных количеств ДНК i для
создания банка генов паразита.
3.1.1 .Создание и амплификация библиотеки . в фаге X 1.
3.1.2. Элюция фрагмента кДНК эхинококка из геля легкоплавкой агарозы
3.1.3. Клонирование фрагмента гена Е. в векторной системе фаг X 1 клетки Е. i ,
3.1.4. Проведение ДНКДНК гибридизации.
3.1.5. Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе клетки .i
3.1.6. Анализ рекомбинантных белков, синтезированных в векторной системе клетки .i штамма рекомбинантный фаг X
3.1.7. Иммунологический анализ рекомбинантных белков, получаемых в векторной системе на основе рекомбинантного фага X 1 методом анализа.
3.1.8. Синтез генноинженерных белков в векторной системе на основе рекомбинантного фага .
3.1.9. Переклонирование фрагмента к ДНК эхинококка в плазмидные векторные системы.
3.1 Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности клонированного фрагмента
3.1 Конструирование рекомбинантных плазмид с использованием векторов семейства рвЕХ и рСДЕ
3.1 Векторы семейства рвЕХ.
3.1 Клонирование фрагмента гена Егатйозиэ в плазмидной векторной системе ррЕБС 9.
3.1 Использование ПЦР при получении фрагментов генов, кодирующих антигены эхинококка для оптимизации создания плазмидных векторных систем.
3.1 Создание продуцента рекомбинантных белков в векторной системе плазмида рЗЕ клетки Е. соН 9.
3.1 Протективная эффективность рекомбинантного антигена ЕЕ
Обсуждение полученных результатов.
Практические предложения
Список литературы


Одобрен секцией Инвазионные болезни животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН мая года, опубликован в томе Труды ВИГИС. Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка ЕВ. Утверждн Ученым советом ВИГИС б июля г. Патент на изобретение Способ получения рекомбинантного антигена Р ЕгатйоБиБ 3, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ г. Апробация результатов. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями Москва, , , гг. Координационного совещания по ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции Инвазионные болезни животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН гг. Ученого совета ВИГИС гг. ДНК Н. Публикации. По теме диссертации опубликовано работ. Объм и структура работы. Диссертация изложена на 5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 5 источников, в том числе отечественных и 9 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и рисунками. Биологические и морфологические особенности эхинококка. Эхинококкоз тяжелое паразитарное заболевание человека и жвачных животных, вызываемое личиночной формой гельминтов i и i ii. Характеризуется развитием в печени, легких, селезенке и других органах солитарных и множественных кистозных образований. Имагинальная стадия этих гельминтов. Половозрелая форма гельминта паразитирует в тонком отделе кишечника многих плотоядных животных собак, кошек, волков, куниц, лис, рысей, хорьков Бессонов , Ястреб В. Б.,. Эхинококкоз распространен по всему миру, но особенно часто регистрируется это заболевание в странах с пастбищным животноводством. Необходимо отмстить, что в связи с резко возрастающими миграционными процессами, массовым и бесконтрольным завозом продуктов из южных регионов, где в последние годы изза отсутствия средств не проводится дегельминтизация плотоядных животных, на территории Европейской части России регистрируется все больше и больше случаев заболевания людей эхинококкозом Акматов Б. А., Чобанян А. Г., . Так, в последние годы в госпитале имени Бурденко было прооперированно более 0 человек, при этом отмечалось 2,5 летальных исходов и рецидивов заболевания. Эхинококковая киста растет экспансивно, отодвигая ткани хозяина. В окружающих тканях развиваются дистрофические изменения, атрофия паренхимы, что связано с механическим давлением растущей кисты, а также с сенсибилизирующим воздействием паразитарных антигенов. При разрыве жизнеспособной кисты, содержащей протосколексы, происходит дессеминация эхинококков с развитием вторичного множественного эхинококкоза. Обычно клинические признаки вторичного эхинококкоза выявляются через года после разрыва, но достаточно часто наблюдается быстрое, галлопирующее, течение процесса, что проявляется быстрым ростом кист, склонностью к их повторным разрывам и дессеминацией возбудителя. Такое злокачественное течение эхинококкоза чаще наблюдается у неиммуных, временно пребывающих в очагах инвазии лиц, например у военнослужащихевропейцев в Кавказском и Среднеазиатском регионах Бессонов , . Антигенный состав эхинококка. По своей природе антигены гельминтов можно классифицировать как функциональные, основу которых составляют главным образом экскреты и секреты паразитов, и соматические потенциальные, содержащиеся в тканях гельминта Бережко В. К., . В процессе онтогенетического развития антигены паразита претерпевают значительные изменения, направленные на сближение с белками хозяина. Антигенная адаптация начинается с личиночной стадии паразита в организме промежуточного хозяина и сохраняется у взрослого паразита и дефинитивного хозяина. Онкосферы многих цестод имеют общие антигенные детерминанты со стадиями жизненного цикла некоторых гельминтов, но вместе с тем они содержат уникальные стадиоспецифические детерминанты, свойственные только им. Перекрестные реакции между антигенами . I . I .