Разработка и применение цитоспектрофотометрического метода изменения величины рН в живой клетке

• Автор: Оглоблина, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 172 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. РОЛЬ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ КЛЕТОК

1.1.Влияние на внутриклеточные процессы . .

1.2.Анализ методов измерения внутриклеточных . .

1.2.1.Измерение выделенной из клеток ЦИТО

плазмы простыми электродами .

1.2.2.Микроэлектронный метод определения внутриклеточного .

1.2.3.Определение клеток по распределению жирорастворимых слабых кислот или оснований

1.2.4.Определение клеток с помощью колориметрии или флуориметрии2,

1.2.5.Метод определения клеток с помощью

ядерномагнитного резонанса. . .2.
ГЛАВА П. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО . ТОЧНОСТЬ МЕТОДА.
П.1. Выбор красителя
П.2. Материал и методы
П.З. Обоснование метода
П.3.1. Результаты спектрального анализа растворов нейтрального красного. Выбор длин волн
П.3.2. Построение калибровочных кривых.
П.4. Анализ погрешностей метода. .
П.4.1. Правомочность экстраполяции зависимости КрН в область ной концентрации нейтрального красного.
П.4.2. Точность определения структур с раз ,
личной концентрацией нейтрального красного.
П.4.3. влияние накопления нейтрального красного на самой структуры.
П.4.4. Связь нейтрального красного с белками. . . 7
П.4.5. Связь нейтрального красного с мембранами. .
П.4.6. Изменение ионной силы среды
П.4.7. Спектральная ширина щели монохроматора. . .
П.4.8. Точность записи спектра
П.4.9. Рассеянный свет эффект ШварцшильдаВил
лигера.
П.4 Свет люминесценции нейтрального красного.
П.4.II. Положение измерительного зонда и фокусировка объекта.
П.4 Суммарная ошибка измерения . Проверка
разработанного метода.
ГЛАВА Ш. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИС0М И ЦИТОПЛАЗМЫ В НОРМЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.
Ш.. Краткая характеристика лизосомального аппарата клеток
Ш.2.Нейтральный красный и гранулообразование в клетках.
Ш.З. Материал и методы
Ш.4. Определение и характеристика лизосом клеток
культуры ткани .
Н.5. Оценка возможного влияния температуры инкубации на
состояние клеток и величину внутрилизосомального .,
1.5.1. Обоснование проведения экспериментов при С ,3 Ш.5.2. Сравнение включения 3Нтимидина в ДНК клеток при и С
Ш.5.3. Сохранение клетками способности к делению и к синхронизаций митозов после длительного воздействия комнатной температуры .
1.5.4. Сравнение лизосом клеток при и С.
1.6. Влияние различных агентов на внутряклеточных
структур
Ш.6.1. Влияние концентрации нейтрального красного
в среде на внутриклеточных структур.
Ш.6.2. Влияние среды на величину лизосом
и цитоплазмы
Ш.6.3. Действие протоносроров на величину лизосом и цитоплазмы клеток.
1.6.4. Действие моноиодацетата. .
Ш.6.5. Действие амитала
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


,, . , i ,, . i . Однако, о механизмах создания и поддержания кислого в лизосомах пока нет единого мнения, а о постоянстве или вариабильности в них известно мало ii, ,i, . Измерение в живой клетке, а тем более в отдельном е органоиде связано с большими трудностями и требует разработки специальных методов. Анализ методов измерения внутриклеточных тэН. Превые определения кислотности внутриклеточной среды были сделаны в конце прошлого века И. И.Мечниковым при изучении пищеварения у простейших см. В дальнейшем все возрастающий интерес исследователей к изучению величины и характера изменения живых клеток привел к возникновению и развитию разнообразных и многочисленных методов для решения этой задачи. Рассмотрим их подробнее. Л.Измерение рНвццеленной нзклеток цитош1азшпростшш электродами. Это самый старый количественный метод определения , простой и быстрый, который использовали для измерения кислотности клеточного сока растений и лизатов или гомогенатов клеток животных. Первые достаточно точные измерения внутриклеточных были проведены в году Фуросавой и Керриджем на гомогенатах скелетных мышц И сердечной МЫШЦЫ кошек , Кегi, . Для скелетных мышц величина оказалась равной 6. Эти результаты хорошо согласуются с современными сердечной мышцы крысы 6. i,, , КОШКИ 6. ,, . Такое же совпадение характерно и для значений эритроцитов человека измерение их лизатов простыми электродами дали величину 7. интактных эритроцитов, измеренный с помощью других методов 7. ii,i, . Однако, при измерении гомогенатов высококомпарментализярованных клеток возможны существенные ошибки изза влияния примеси органоидов и клеточных мембран, которые обладают системами быстрого транспорта протонов и могут значительно изменить гомогената. Например, яиц морских ежей, измеренный в их гомогенатах, составлял 6. ,i, . Описываемый метод имеет следующие существенные недостатки ограниченность применения преимущественно для клеток с невысоким уровнем компартментализации опасность изменения исходной величины гомогената вследствие загрязнения его большим количеством органоидов, обломками клеточных мембран, буферами наружной среды, гликокаликсом и т. для большого числа клеток т. клеток возможность только одного измерения величины для каждой популяции клеток. Естественным развитием электродного метода определения в гомогенатах стала разработка микроэлектродного метода для измерения в единичной клетке. Оба электрода вводят в одну клетку как можно ближе друг к другу, чтобы не возникало разности потенциалов между ниш. Если клетка мала для введения обоих электродов, то второй электрод вводят в соседнюю клетку. В этом случае измерения будут менее точны. Время регистрации зависит от диаметра кончика электрода и увеличивается с уменьшением диаметра для электрода, диаметром мкм время измерения составляет I сек, диаметром 48 мкм 13 минуты, а диаметром 2 мкм 5 минут , , . Диапазон измеряемых значений от 4 до 8 ед. Для разных целей и объектов разными авторами разработано несколько видов микроэлектродов. Самые первые электроды были металлическими, например, из черной платины. Затем появились стеклянные микроэлектроды с сурьмяным покрытием и стеклянные микроэлектроды ИЗ Н чувствительного стекла. Существует несколько разновидностей таких электродов. , , . Результаты измерения с помощью микроэлектродов хорошо совпадают с результатами, полученными другими методами. Так, при измерении с помощью микроэлектродов МЫШЦ кошки, краба и лягушки получены значения 6. сердечной мышцы крысы и морской свинки 7. i, , i, , . Измерения с помощью других методов дали близкие результаты сердечной мышцы крысы, человека и собаки составляют соответственно 7. i, I4iii , .