Получение направленных мутаций в гене устойчивости к тетрациклину плазмиды pBR322

• Автор: Мазин, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 135 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава I. Обзор литературных данных

1.1. Методы направленного мутагенеза i vi IЛЛ. Получение локализованных мутаций

в результате рекомбинации фрагментов ДНК

1Л.2. Индукция локализованных мутаций путем химической модификации однонитевых участков ДНК .

1.1.3. Индукция локализованных мутаций

путем введения модифицированных нуклеотидов

1.1.4. Индукция локализованных мутаций с помощью неполностью комплементарных ДНКматрице олигонуклеотидных затравок.
1Л.5. Индукция направленных мутаций с помощью комплементарных полинуклеотидов, несущих

алкилирующие группы

I.I.6. Направленный мутагенез i viv.
Подходы и перспективы
1.2. Ген, ответственный за устойчивость
к тетрациклину плазмиды 2 экспериментальная мишень для направленного мутагенеза
Заключение к главе 1.
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы.
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение ДНК
2.2.2. Выделение фрагментов рестрикции ДНК. .
стр.
2.2.3. Введение радиоактивной метки во фрагменты ДНК
2.2.4. Гидролиз II
фрагмента рестрикции ДНК экзонуклеазой III из .i для получения однонитевых фрагментов. .
2.2.5. Присоединение полифункционального алкилирующего реагента ТФП к молекулам ДНК.
2.2.6. Гибридизация нуклеиновых кислот. .
2.2.7. Внутрикомплексное алкилирование. .
2.2.8. Денатурация гибридных комплексов. .
2.2.9. Хроматография ДНК на оксиапатите. .
2.2 Трансформация клеток .i
ДНК плазмиды 2
2.2 Определение первичной последовательности ДНК
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Присоединение алкилирующего реагента
ТФП к ДНК. Устойчивость алкилированных оснований. .
3.2. Исследование способности ДНК, модифицированной ТФП, к комплементарному комплексообразованию. .
3.3. Разработка метода направленной модификации генов, клонированных в плазмидах.
3.3.1. Получение однонитевой
ДНКносителя алкилируицих групп
3.3.2. Разработка метода гибридизации ДНКносителя аллидирующих групп с суперспирализованной ДНК плазмиды
стр.
3.4. Получение направленных мутаций в гене Тсг плазмиды рВИ2
3.5. Определение характера изменений в
первичной структуре полученных мутантов.
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Использование ДНК в качестве носителя алкилирующих групп
4.2. Эффективность и направленность разработанного метода мутагенеза
4.3. Определение характера индуцированных
мутаций. Предполагаемый механизм их возникновения. . .
4.4. Вероятная эволюционная роль механизма,
индуцирующего образование тандемных повторов
Глава 5. Заключение.
Глава 6. От автора.
Список использованной литературы


Избыточные делеции возникали после трансфекции и в том случае, когда фрагмент рестрикции выщеплялся последовательным гидрзолизом двумя различными рестриктазами i, , . Авторы приведенных работ считают, что такие делеции возникают в результате внутриклеточного гидролиза экзонуклеазами концов рестриктированных ДНК до их лигирования. Для этого однонитевую кольцевую ДНК фага iX отжигали с фрагментом рестрикции ДНК ХПЧ , содержащем два сайта узнавания для рестриктазы iII. Затем гидролизовали образовавшийся частичный гибрид рестрдактазой iII. Разрывы возникали только в двух сайтах в пределах дуплекса. Нуклеотидный анализ ДНК выделенных после трансфекции мутантов показал наличие делеций между двумя сайтами iII. Выла обнаружена также делеция большего на одну нуклеотидную пару размер, возникшая по мнению авторов в результате присутствия в реакционных смесях загрязняющей их экзонуклеазы. Методы, основанные на вырезании фрагмента рестрикции,могут быть эффективно использованы только в случае удачного расположения двух сайтов рестрикции. , . Для этого кольцевую молекулу ДНК вируса гидролизовали эндонуклеазой рестрикции, имеющей в этой молекуле единственный сайт узнавания, находящийся в интересующем авторов районе. Полученную линейную молекулу подвергали ограниченному гидролизу А экзонуклеазой, при котором с каждого 5 конца отщеплялось по нуклеотидов. Было проанализировано 6 мутантов, выделенных после трансфекции клеток 5 из них содержали делеции от до пн, у шестого мутанта неожиданно была обнаружена вставка размером в пн. Ковалентно замкнутая структура ДНК, очевидно, может восстанавливаться в клетке путем гибридизации коротких комплементарных последовательностей однонитевых ъ концевых участков, образовавшихся в результате гидролиза А экзонуклеазой. При этом в процессе удаления неспаренных оснований в репарации однонитевых брешей образуются делеционные мутанты. В более поздних работах вместо А экзонуклеазы для ограниченного гидролиза концов ДНК, использовали нуклеазу , , экзонуклеазу III , , нуклеазу i , , i, , а также комбинацию экзонуклеазы III и нуклеазы , , , . Все эти методы позволяют получить небольшие делеции, локализованные в районе уникального единственного на молекулу ДНК сайта рестрикции рис. Б. В том едукогда в изучаемом районе кольцевой ДНК нет уникального сайта рестрикции могут быть применены методы, позволяющие получать статистический набор делеционных мутаций. Впервые такой подход был предложен в работе Шенка , для получения статистического набора делеций в ДНК вируса V. ДНКазой в присутствии Мп . ДНКаза в этих условиях образует небольшое количество двунитевых разрывов, статистически распределенных по молекуле ДНК вируса, превращая кольцевую ДНК в линейную. Затем линейные молекулы равные по длине полной вирусной ДНК выделяли электрофорезом, гидролизовали Аэкзонуклеазой и использовали для трансформации клеток пермиссивных линий. Среди полученных трансформантов были отобраны клоны, содержащие делеционные мутанты V. Из полученного набора мутантов отбирали интересущие исследователей. Для получения набора делеционных мутаций могут быть использованы также однонитевые разрывы, статистически распределенные в кольцевой ДНК. Такие разрывы образуются в ДНК при гидролизе ее панкреатической ДНКазой в присутствии бромистого этидия i , , а также при облучении видимым светом комплексов, образованных ею с бромистым этидием , . Однонитевые разрывы после их энзиматического расширения экэонуклеазами , , могут служить мишенью для 1 нуклеазы, гидролиз которой приводит к вщеплению участков ДНК в районе однонитевых разрывов i , . После получения делеционного мутанта часто бывает необходимо увеличить делециг. Был предложен общий метод увеличения размера делеций путем образования кольцевого гетеродуплекса между ДНК мутанта и дикого типа, открытия кольца и удаления нескольких нуклеотидов в районе делеционной петли гидролизом нуклеазой , .