Миграция транспозонов и нереплицирующихся плазмид в клетках фототрофной азотфиксирующей бактерии Rhodopseudomonas sphaeroides

• Автор: Дубейковский, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. .

2.1 Мигрирующие генетические элементы прокариот.

2.1.1 Определение и классификация мигрирующих генетических элементов.

2.1.2 Структурная и функциональная организация

1Б последовательностей.Ю

2.1.3 Сложные транспозоны.

2.1.4 Транспозон ТпЗ и родственные ему транспозоны . . .

2.1.5 Мигрирующие бактериофаги .

2.1.6 Эффекты, вызываемые мигрирующими элементами

в реципиентной ДНК регуляция действия генов .
2.1.7 Перестройки,индуцируемые мигрирующими
элементами в реципиентной ДНК.
2.1.8 Эксцизия мигрирующих элементов .
2.1.9 Образование коинтегратов мигрирующими
элементами .
2.1. Обратная транспозиция .
2.1. Специфичность транспозиции мигрирующих
элементов .
2.1. Мутации хозяйского генома, влияющие на события незаконной рекомбинации, ассоциированные с мигрирующими элементами
2.1. Модели транспозиции
2.2 Генетический анализ у фотосинтезирующих
пурпурных бактерий .
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Бактериальные штаммы
3.2 Плазмиды и бактериофаги.
3.3 Среды и реактивы
3.4 Конъюгационные скрещивания
3.5 Определение частоты транспозиции
3.6 Иммунность к колицину Е
3.7 Несовместимость автономных плазмид.
3.8 Получение спонтанных ав.8вариантов плазмиды
3.9 Мутагенез
3. Ампициллиновое обогащение
3. Поиск ауксотрофов, индуцированных внедрением транспозона Тп7 и плазмид рА1рА. .
3. Выделение плазмидной ДНК.
3. Выделение ДНК фага .
3. Обработка препаратов ДНК эндонуклеазами
рестрикции.
3. Электрофоретический анализ препаратов ДНК
3. Определение молекулярного веса фрагментов
линейной ДНК.
IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Миграция транспозона тп с плазмиды рАБвг
В геном ЕЬ. враегоНев 2В.
4.2 Локализация включений транспозона Тп7 в геноме .i. 2Е
4.3 Включение транспозона Тп7 в геномы штаммов 5,
2.Д ,Е ЕЬ. БрЬаегойеа.
4.4 Получение плазмиды рАБТп5 и е Стр.
введение


Потенциально у iiэлемента существуют ещ 4 области, способные кодировать небольшие полипептиды. Однако, для этих участков не найдено собственных промоторов и поэтому неясно, синтезируются ЛИ С НИХ полипептиды i viv i . Для способного к индивидуальной транспозиции элемента I . Показано, что последовательность I определяет синтез двух белковых продуктов белка I 1 аминокислотный остаток и белка 2 1 аминокислотный остаток. Белки кодируются перекрывающимися областями мигрирующего элемента, так что белок 2 гомологичен белку I, но не имеет концевых аминокислотных остатков. Оба белка синтезируются в малом количестве, но белка 2 в четыре раза больше, чем белка I i, . Любое нарушение в белке один приводит к исчезновению способности к транспозиции у Кэлемента. Из этого исследователи заключают, что белок I либо сам фермент транспозаза, либо е необходимый компонент. Мутации по белку I не комплементируются эффективно i , но способны восстанавливать способность к транспозиции при комплементации i i i, v, . Так что транспозаза 5СЖэлеыента является iдействующим белком, что отличает е от подобных белков других мигрирующих элементов. При этом, б смысле предпочтительности взаимодействия с транспозазой, концевые инвертированные повторы элемента I не идентичны. Анализ свойств элемента в составе транспозона Тп5 показал, что один из концов элемента используется взаимодействует с транспозазой чаще i. Белок 2, с другой стороны, является единственным продуктом, необходимым для регуляции транспозиции. Вопервых, только синтеза белка 2 достаточно для блокирования i повторной миграции I тп5 . При этом степень ингибирования процесса прямо зависит от количества синтезируемого белка 2 i. Вовторых, мутанты по синтезу белка 2 не способны к ингибированию повторной транспозиции Iэлемента. Характер ингибирования белком 2 выявили, сконструировав штаммы со слившимися генами белков I и 2 и геном галактозидазы i i. Оказалось, что в условиях ингибирования транспозиции, скорость синтеза обоих слившихся белков не изменяется. Таким образом, регуляция белком 2 осуществляется не на уровне регуляции количества синтезируемого белкатранспозазы и самого белка 2 как это наблюдается у других мигрирующих элементов см. I транспозазы. Возможным механизмом регуляции в этом случае является конкуренция между белками I и 2 за места связывания концевые последовательности Тп5элемента. Для других Iэлементов данные о структуре и функциях менее полные. Для II и I4 элементов обнаружено, что, делеционные и инсерционные мутанты элементов имеют сниженную способность к миграции i, , i. Для 5элемента показано наличие двух перекрывающихся кодирующих областей большой и малой в противоположной ориентации , , . Белки, определяемые кодируемыми областями элементов I2 И I4, обнаруживаются меньшего молекулярного веса, чем это следует из анализа нуклеотидной последовательности соответствующих районов ДНК цит. Сложные транспозоны. Как отмечалось выше, некоторые транспозоны содержат в своем составе iэлементы, ограничивающие в прямой или обратной ориентации уникальную центральную область, кодирующую различные функции. Продемонстрировано, что у большинства таких сложных элементов способность к миграции определяется концевыми одним или обоими iэлементами, сохраняющими к тому же способность мигрировать индивидуально цит. Так, у транспозонов тп5, Тою, Тп3 способность к транспозиции, е специфичность, размер дупликаций реципиентной ДЕК обычно, 9 п. I, II, I3 i, , , . ЭТО позволяет отнести Iпоследовательности и сложные транспозоны к одному типу мигрирующих элементов. Однако, свойства сложных транспозонов не полностью идентичны свойствам входящих в них iэлементов. Действительно, манипуляция с концевыми Iэлементами транспозона Тп5 . Кроме того, для транспозонов Тп5 и i показано различие между двумя концевыми повторами I элементов I И I. Отличие между элементами II И II составляет позиций из 5 изученных, что приводит к различию в частотах миграции, обеспечиваемой левым и правым плечами транспозона тшо, более чем в 0 раз i .