Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli.

• Автор: Фомина, Светлана Александровна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Путь биосинтеза пролина

1.1. уГ лутамил киназа

1.2. уГлутамилфосфатрсдуктаза

1.3. Пнрролин5карбоксилатредуктаза

1.4. Обходной путь образования Ьглутамат5полуальдегида в клетках Е. i

1.5. Организация генов пути биосинтеза пролина

1.6. Пары токсинантитоксин

1.7. Регуляция пути биосинтеза пролина

2. Транспорт и деградация пролина

2.1. Транспорт пролина и осморезистентность
2.2. Деградация пролина 3. Продуценты пролина
4. Предшественники пролина
4.1. Глутаминовая кислота структурный предшественник пролина
4.1.1. Глутаматдегидрогеназа
4.1.2. Глутаматдекарбоксилазы
4.2. аКетоглутаратдегидрогеназа.
4.3. Фосфопируваткарбоксилаза Часть II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды и среды
1.1. Получение мутантов
1.2. Получение мутантов, резистентных к структурным аналогам пролина.
2. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК 2.1. Трансформация, трансдукция, клонирование i viv
3. Ферментации
3.1. Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости
4. Определение активностей ферментов
4.1. Приготовление экстрактов клеток для определения активности
ферментов
4.2. Определение активности углутамилкиназы ГК
4.3. Определение активности углутамилфосфатредуктазы ГФР
4.4. Определение активности Дпирролинбкарбоксилатредуктазы ПКР
4.5. Определение активности фосфопируваткарбоксилазы ФПК
4.6. Определение активности акетоглутаратдегидрогеназы
4.7. Определение активности глутаматдегидрогеназы ГДГ
5. Использованные программы компьютерного анализа.
Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Усиление биосинтеза пролина в штамме . i 2 за счет снятия ретро ингибирования ферментов этого пути, амплификации содержащих необходимые мутации генов пути биосинтеза пролина, а также блокирования известных путей деградации пролина.
1.1. Селекция и свойства полученных аналогорезистентных мутантов штамма .i К продуцентов пролина.
1.2. Получение ауксотрофных мутантов . i 2 по пролину пенициллиновым методом обогащения.
Ч 1.3. Клонирование i viv фрагментов хромосомы . i,
комплсментирующих пролиновую ауксоторофность.
1.4. Минимизация фрагмента хромосомы штамма 0, содержащего ргоВА оперон.
1.5. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами Ъ и V.
1.6. Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина.
1.7. Идентификация мутации в генергоВ.
1.8. Результаты амплификации генов пути биосинтеза пролина в клетках штамма . i 0.
2. Оптимизация уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе предшественников пролина.
2.1. Клонирование и интеграция в хромосому штамма ВА дополнительных копий гена .
2.2. Анализ потоков распределения углерода штаммах с амплифицированными генами ргоВА и с помощью ЯМР спектроскопии.
2.3. Оптимизация уровня экспрессии генов путем замены их нативного промотора в составе бактериальной хромосомы.
2.4. Клонирование и интеграция в хромосому штамма ВА генаррс. Определение оптимальной активности фосфоснолпируваткарбоксилазы в
клетке для биосинтеза пролина.
2.5. Роль глутаматдсркарбоксилазы в пути биосинтеза пролина.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Другой важной функцией пролина является его роль универсального осмопротектора в клетке, поэтому, с развитием биотехнологии, путь биосинтеза пролина быстро стал объектом генетических экспериментов, особенно в растениях, где коммерческая ценность сорта определяется в том числе его устойчивостью к засухе и засоленности почвы. Недавно были опубликованы данные о практическом использовании еще одной функции пролина в клетке. В статье Морита i . С, что имеет большое значение, в частности для производства полуфабрикатов из теста. Путь биосинтеза пролила в разных группах живых организмов имеет лишь незначительные отличия. Таким образом, изучение влияния уровня экспрессии генов пути биосинтеза Ьпролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию Ьпролина в хорошо изученном штамме Е. И К, а также создание спектра генетических конструкций, содержащих гены биосинтеза Ьпролина, в том числе мутированные с повышением активности кодируемых ими ферментов, является актуальным и экономически обоснованным. Ьпролина. Часть I. Путь биосинтеза пролина. В живых организмах синтез пролина осуществляется несколькими путями у бактерий и у растительных клеток в условиях осмотического стресса основным предшественником пролина является глутамат, в животных и некоторых растительных клетках пролин синтезируется из орнитина. Поскольку пролин является первичным метаболитом, то путь его биосинтеза относительно прост, универсален и хорошо изучен. У ii i как и у большинства бактерий, пролин образуется из глутамата в результате четырех последовательных реакций, катализируемых ферментами углугамилкиназой ГК продукт генаргоВ ЕС 2. ГФР продукт гена А ЕС 1. П5КР продукт генаргоС ЕС 1. Оставшаяся, третья по счету реакция структурной перестройки глутамат5полуальдегида в Дпирролинбкарбоксилат, протекает самопроизвольно. Ключевой фермент биосинтеза пролина углутамилкиназа ингибируется пролином по принципу обратной связи. Эксперименты с очищенным ферментом показали, что, помимо ингибирования пролином, активность ГК в меньшей степени регулируется глутаматом и АДФ, таким образом осуществляя тонкую настройку синтеза пролина по отношению к субстрату и к доступной энергии i, i, . Путь биосинтеза пролина в клетках ii i представлен на Рисунке 1. Рис. Путь биосинтеза пролина в . Н , глутаматБсемиальдегид

пролин
Путь из глутамата через глутаматусемиальдегид и продукт его спонтанной циклизации Р5С был впервые предложен Вогелем и Девисом в году V, . В. . Р5С, позволяет расти другому виду пролиновых ауксотрофов. Эксперименты с изотопами показали, что добавление не меченного иолуальдегида уменьшает включение С глутамата в пролин и, таким образом, подтвердили предложенный путь. Другим важным этапом в развитии модели пути биосинтеза пролина явилась демонстрация того факта, что ретроингибированис пролином происходит на стадии между глутаматом и глутаматусемиальдегидом. Предположили, что в превращении из глутамата в глутаматусемиальдегид участвует активированная форма глутамата, както углутамилфосфат. Бейк i, . АТРзависимое фосфорилирование глутаминовой кислоты. Мутант . Это открытие подтвердило существование углутамилкиназы, специфичной для первой реакции в пути биосинтеза пролина, и привело к окончательному формированию представлений о биосинтезе пролина. Ферменты этого пути были также обнаружены и в других прокариотах i , i, viiv. Рассмотрим подробнее, что же известно об основных ферментах пути биосинтеза пролина. Глутамилкиназа. Как уже упоминалось выше, первый и ключевой фермент биосинтеза пролина углутамилкиназа в клетках . АТФзависимое фосфорилирование укарбоксильной группы глутаминовой кислоты. Вопервых, это чрезвычайная нестабильность углутамил фосфата и тенденция к самопроизвольной циклизации в 5оксопирролидин2карбоксилат , . Предполагается, что это вещество присутствует i viv в клетке в форме комплекса с ферментом. Исследования показали, что аналог глутамата, циклоглутамат, способствует образованию углутамил фосфата в первой реакции биосинтеза пролина, из чего делается вывод, что углутамил фосфат взаимодействует с радикальной группой такой как тиол на углутамилфосфатредуктазе с образованием углутамилферментного комплекса , А.