Изучение молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований щитовидной железы

• Автор: Васильев, Евгений Витальевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ

1.1. Клиническая характеристика злокачественных опухолей ЩЖИ

1.1.1. Гистологическая классификация РЩЖ.

1.1.2. Клиникоэпидемиологическая характеристика РЩЖ.

1.2. Молекулярногенетические аспекты патогенеза МРЩЖ

1.3. Молекулярногенетические аспекты патогенеза опухолей ЩЖ фолликулярного происхождения.

1.3.1. Рецептор тнреотроиного гормона

1.3.2. Протоонкоген КЕТ

1.3.3. Перестройка РАХ8РРАЯу.
1.3.4. Протооикоген ЛТЯК7
1.3.5. Протоонкогены семейства М5.
1.3.6. Протоонкоген ЯМГ.
1.3.7. Протоонкоген МЕТ
1.3.8. Генысупрессоры роста опухолей
1.4. Резюме
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика клинического материала.
2.2. Забор крови и операционного материала.
2.3. Выделение геномной ДНК
2.4. Выделение РНК из крови и операционного материала
2.5. Спектрофотометрическое определение концентрации РНК.
2.6. Синтез кДНК.
2.7. Полимеразная цепная реакция.
2.7.1. ПЦР кодирующих районов гена КЕТ.
2.7.2. Сравнительный анализ экспрессии ЕС и ТК доменов Г
методом полуколичественной КТРСЯ.
2.7.3. Идентификация перестроек КЕТРТСЕ КЕТРТС2, ЯЕТРТСЗ иЛШУЯ7методом ЯТРСЯ
2.7.4. Аллельспецифическая амплификация мутантного аллеля ВКЛЕ
2.8. Рестриктный анализ
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК
2.9.1. Электрофорез ДНК в неденатурирующем ПААГ.
2.9.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
2 Детекция точковых мутаций методом .
2Окрашивание ПААГ нитратом серебра.
2 Определение нуклеотидной последовательности
2 Программное обеспечение
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Молекулярногенетический анализ гена у больных
с наследственной и спорадической формами МР1ЦЖ.
3.2. Перестройки в тканях ПРЩЖ и других узловых
образований ЩЖ.
3.3. Спектр и частота соматических мутациий гена
при ПРЩЖ и других узловых образовниях ЩЖ.
3.4. Молекулярногенетический анализ протоонкогенов и
у больных с семейным ПРЩЖ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Цель работы изучение наследственных и соматических молекулярногенетических изменений, ассоциированных с развитием наиболее частых вариантов РЩЖ и разработка экспериментальных подходов к ранней и досимгттоматической диагностике злокачественных новообразований ЩЖ. Провести поиск и характеристику герминальных мутаций протоонкогена у пациентов с различными формами МРЩЖ. Разработать скрининговый метод выявления химерных онкогенов в тканях узловых образований ЩЖ на основе определения гиперэкспрсссни тирозинкиназного домена с помощью полуколичсствснной . Определить частоту химерных онкогенов в узловых образованиях ЩЖ и провести идентификацию наиболее распространенных вариантов перестроек в положитсльных образцах. Определить частоту мутаций протоонкогена i в тканях различных узловых образований ЩЖ. Оценить диагностическую значимость перестроек и соматических мутаций в качестве потенциальных маркеров злокачественности новообразований 1ЦЖ. В результате проведенного исследования изучен спектр мутаций протоонкогена у больных с семейной и спорадической формами МРЩЖ. Выявлено различных мутаций протоонкогена у человек из семей. Впервые идентифицирована комплексная герминальная мутация деления с инссрцисй без сдвига рамки считывания i4 в II экзонс и впервые в России обнаружена редкая геминальная трансвсрсия 1. МРЩЖ являются миссснсмугации внеклеточного цистеинбогатого домена. Впервые выявлена молчащая мутация 1 в семье с наследственным ПРЩЖ. Впервые в России охарактеризована частота соматических перестроек и мутаций гена в выборке спорадических узловых образований ЩЖ и показана специфичность этих нарушений для ПРЩЖ. В двух случаях ПРЩЖ выявлены редкие или не охарактеризованные варианты перестроек , а также обнаружен новый онкоген в ткани радиационноиндуцированного ПРЩЖ. Помимо стандартной замены ТЛ, впервые при ПРЩЖ описаны две новые соматические мутации гена А Е5К и деления 0. Механизм онкогениого действия последней мутации, затрагивающей активирующий сегмент киназы может представлять теоретический интерес для изучения регуляции ее активности. В результате проведенного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии гена при наследуемых формах МРЩЖ. Проведена ДНКдиагностика у больных с МРЩЖ из неродственных семей, а также у их здоровых родственников. Практическая значимость работы связна с возможностью досимптоматической диагностики МРЩЖ среди лиц повышенного риска, а также выявления новых семейных случаев МРЩЖ. У человек герминальные мутации обнаружены до начала клинической манифестации заболевания, а профилактическое хирургическое лечение проведено четырем из них. У обследованных здоровых родственников носительство мутации было исключено. Наследственный характер заболевания установлен для пациентов со спорадическим МРЩЖ из семей. Высокая частота перестроек и мутаций гена в обследованных тканях ПРЩЖ . ПРЩЖ делает эти генетические нарушения перспективными молекулярными маркерами злокачественности для дооперационной дифференциальной диагностики ПРЩЖ. РЩЖ и поражает людей трудоспособного возраста лет. С этим связана социальноэкономическая значимость результатов настоящего исследования. Методы, использованные в данной работе, вполне доступны и могут быть адаптированы к применению в клинических лабораториях. Результаты исследования внедрены в практику МРНЦ РЛМН Обнинск и ЭНЦ РАМН. Определены частота и спектр мутаций протоонкогена при различных формах МР1ДЖ наибольшую диагностическую значимость имеют мутации цнстснибогатой области внеклеточного домена . Разработан эффективный скрининговый метод выявления химерных онкогенов с помощью сравнительного анализа экспрессии внеклеточного и каталитического доменов . Соматические перестройки и мутации гена специфические молекулярные маркеры ПРЩЖ, которые представляют собой альтернативные механизмы активации . МАРкиназного каскада в этиопатогенезе ПРЩЖ. Соматические мутации гена i при ПРЩЖ достоверно чаще встречаются у пациентов старшей возрастной группы.