Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз

• Автор: Зинин, Николай Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Значение iаз для кормопроизводства. .

2. Источники ФИТ 3.

2.1. Скрининг фитаз у микроорганизмов

2.2. Фитазы грибного происхождения

2.2.1. 1итаза i i

2.2.2. 1итазы из и базидиомицстов

2.2.3. Тсрмостабнльная фкгаза i i .

2.2.4. Дрожжевые фитазы .

2.3. Бактериальные фитазы
.1. Фитаза ЛррАЕ i
2.3.2. фитазы бактерий родов i И i
2.3.3. 1итазы башетл
3. Филогенетическая классификация фитаз.
4. Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств.
4.1. Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз
4.2. Бациллярные щелочные фитазы .
4.3. Фитазы семейства пурпурных кислых росфатаз
5. Биохимические свойства фитаз и их промышленно важные характеристики
6. Изменение свойств белков при помощи методов белковой инженерии
б. 1. Принципы рационального конструирования белков
6.2. Методы направленной эволюции.
6.3. Концепция консенсусной последовательности
6.4. Изменение профиля белков .
7. Экспрессия фитаз в различных системах
7.1. Экспрессия фитаз в бактериях .
7.2. Экспрессия фитаз в дрожжах
7.3. Экспрессия фитаз в грибах .
1I МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды и условия культивирования
2. Штаммы, плазмиды и ошгонуюеотиды.
3. Приготовление образцов фитаз.
4. Свойства ферментов. .
5. Конструирование штаммов i с делецией аррА.
6. ГибридизацияДНК с радиоактивным зондом и изоляция фрагмента ДНК, содержащего ген X, гомологичный гену аррА.
7. Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность
8. Конструирование геномной библиотека и отбор клонов с иско.мой вставкой.
9. Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз.
. Определение концевой аминокислотной последовательности белка .
. Анализ аминокислотных последовательностей.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поиск новых фитаз, продуцируемых бактериями.
1.1. Поиск секретируемых фитаз бактерий . .
1.1.1. Поиск фитаз у природных кзолятов
1.1.2. Поиск фитаз у коллекционных пггаммов
1.2. Поиск внутриклеточных фитаз у грамотрицательных бактерий.
1.2.1. Поиск внутриклеточных фитаз у коллекционных пггаммов
1.2.2. Исследование фитаз у представителей природных популяций Е. сЫг
2. Клонирование гена X, имеющего сходство с аррА . i, но кодирующего фермент с неизвестной функцией .
2.1. Поиск генов, гомологичных аррА у бактерий синтезирующих внутриклеточные фитазы
2.1.1. Поиск гомолошчных генов с использованием ПЦР.
.2. Поиск гомологичных генов с использованием метода гибридизации.
2.1.3. Рсстрихциотюго анализ фрагмента хромосомы О. В, содержащих X.
2.1.4. Исследование других иггаммов О. да наличие гена X.
2.3. Изоляция и се копирование фрагмента из хромосомы О. . содержащего ген X
2.3.1 Создание мутанта с полной делецисй в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов.
2.3.2. Изоляция iсна X с неизвестной функцией, гомологичного аррА . i, из хромосомы О.
2.3.3. Последовательность фрагмента, содержащего ген X.
2.3.4. Экспрессия гена X в . i.
2.3.5. Замена концевой короткой Скошквой части X приводи к воссозданию фигазной активности
3. Клонирование генов, кодирующих внутриклеточные фит азы бактерий
3.1. Изоляция, характеризация и экспрессия гена из бактерии i .
3.1.1. Отбор клонов с фигазной актив юстью из геномной библиотеки
3.1.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента.
3.1.3. Изоляция генов фитаз из других штаммов О.
3.2. Изоляция гена фитазы из бактерии i ii
3.2.1. Отбор клонов с фигазной активностью из геномной библиотеки.
3.2.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента.
3.2.3. Изоляция гена фнгазы из штамма С. ii В
3.3. Изоляция гена фитазы из бактерии Е .
3.3.1. Отбор клонов с фигазной активностью из геномной библиотеки
4. Анализ аминокислотных последовательностей клонированных генов
4.1. Выравнивание последовательностей белковгомологов
4.1.1. Консервативность аминокислотных остатков активного центре.
4.1.2. Консервативность дисульфидных связей.
4.1.3. Сигнальные пептиды
4.1.4. Вторичная структура .
4.1.5. Филогенетическое дерево.
4.2. Вычисление консенсусных последовательностей на основе имеющихся последовательностей фитаз.
5. Экспрессия генов фитаз.
5.1. Экспресиия фитаз в . i 3
5.1.1. Описание системы
5.1.2. Определение удельной активности ферментов
5.1.3.Изучение свойств ферментов .
5.1.4. Субстратная специфичность ферментов.
5.2. Экспрессия фитаз в дрожжах.
5.2.1. Экспрессия АррА . i в различных дрожжевых системах
5.2.2. Экспрессия фитаз . ii и О. в . i
5.2.3. Свойства рскомбинаюных фитаз из Р. i
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Для продукции промышленных ферментов необходимо создание высокоэффективных продуцентов. В данной работе осуществлена экспрессия фитаз в бактериальных и дрожжевых системах, позволяющая нарабатывать ферменты в большом количестве. II. Фитат миоинозитол гсксакисфосфат является преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах масличных и бобовых. В виде фитата накапливается от всего фосфора семян 7. При прорастании семян фитаты уменьшают токсичный эффект свободного железа 5. Фитаты выполняют также и другие важные функции для растений в виде фитатов запасается энергия фитаты участвуют в процессах регуляции фосфорного и минерального обмена , . Животные с однокамерным желудком и человек, такие как свиньи, птицы и рыбы, не способны усваивать фитатный фосфор изза отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтериальном тракте , 6. Фитаты рассматриваются как фактор, понижающий качество кормов т. Кроме того, неусвоенные фитаты попадают в окружающую среду с фекалиями животных. Этот процесс приводит к
значительному загрязнению окружающей среды ,, 9. Ферменты фитазы отщепляют фосфатные группы от фитатов и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усваиваемость фосфора 6, 8, , 1. По классификации i Ii i ii i I фитазы принадлежат к классу гидролаз фосфорных моноэфирных связей или фосфатаз ЕС 3. ЕС 3 гидролазы, ЕС 3. Фитазы образуют несколько семейств ферментов в этом классе описано ниже. В данной работе термин фнтаза употребляется для обозначения ферментов, имеющих большее сродство к фитату, чем к другим фосфорилированным соединениям. С развитием соевой промышленности во второй половине двадцатого века доля рыбной муки в кормопроизводстве уменьшается, в то время как доля сои и семян возрастает. Корма растительного происхождения содержат фитат, следовательно, возрастает потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы. При этом состав ферментов, входящие в состав добавок, в том числе и фитазы, постоянно изменяются так, что предпочтение отдается новым ферментам, лучшим по своим характеристикам. Кроме того, увеличивается разнообразие и количество добавляемых ферментов. В случае фитаз применяются одновременно смеси ферментов, имеющих разные характеристики для достижения максимально высокой суммарной эффективности. Эта эффективность достигается за счет работы ферментов в разных условиях пищеварительной среды, а также различных механизмов отщепления фосфатных групп, позволяющих комплексу ферментов гидролизовать большее количество фосфатных групп. Известно несколько крупных компаний, занимающихся производством кормовых добавок, содержащих фитазы 5. До последнего времени большая часть препаратов фитаз была представлена препаратом марки представляющий собой фитазы разных штаммов гриба i i. По оценкам компании 5 мировыми лидерами производства этой марки являются голландская компания i и финская компания i. В настоящее время другие биотехнологические компании также ведут разработку технологий для производства препаратов, содержащих фитазы. В условиях конкуренции применение будут находить препараты фитаз, имеющие лучшие харакгеристики. Совершенствование фитаз возможно посредством направленного поиска новых ферментов, а также при помощи технологий изменения свойств ферментов методами генной инженерии. Источники фитаз 2. Попадая в почву, фитаты постепенно разлагаются пулом фитаз микробного происхождения. Следовательно, почвенные микроорганизмы перспективны с точки зрения поиска фитаз. Секретируемые фитазы были обнаружены у многих почвенных микроорганизмов. В основном эти организмы были представлены различными грибами и бациллами 1, 2, 5. Почвенные микроорганизмы могут не проявлять фитазную активность в обычных условиях, при выращивании на богатой среде. Однако фитазы в этом случае можно обнаружить, если провести индукцию ферментов. Наиболее логично предположить, что индуцирующими факторами являются фосфорное голодание и наличие в среде фитатов. Этим методом удалось обнаружить несколько фитаз бактерий.