Изучение структурного полиморфизма мобильного генетического элемента МДГ4 (GYPSY) в линиях Drosophila melanogaster

• Автор: Кусулиду Людмила Кириаку
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с.

СОДЕРЖАНИЕ стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

П. 1. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМА ДРОЗОФИЛЫ.

П. 1.1. КЛАССИФИКАЦИЯ МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ.

П. 1.2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДКПРЕТРОТРАНСПОЗОНОВ.

П. 1. 3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ГЕНОМЕ.

П.1.4. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ

П. 1.4.1 .Транскрипционная регуляция.

П. 1.4.2.Постгранскрипционная регуляция экспрессии ретротранспозонов.

.1.4.3. Модификаторы экспрессии МДГ4.
П. 1.5. РОЛЬ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В МУТАГЕНЕЗЕ.
II.1.5.1. МДГ4 индуцируемый мутагенез в локусе .
П.2. СТРУКТУРА РЕГРОТРАНСПОЗОНА МДГ4 .
П.2.1. БЕЛКОВЫЕ ПРОДУКТЫ ОТКРЫТЫХ РАМОК СЧИТЫВАНИЯ
МДГ4 И ИХ СХОДСТВО С ПРОДУКТАМИ РЕТРОВИРУСОВ и ДРУГИХ РЕТРОЭЛКМЕНТОВ.
П.2.1.1. Ген и его продукты
П.2.1.2. Ген .
П.2.1.3. Ген v.
.3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ . И МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ. . у, у
П.3.1. СИСТЕМА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ МУТАТОРНОЙ ЛИНИИ . .
П.3.1.1. История получения мутаторной линии .
П.3.2. ГЕН РЕГУЛЯТОР ТРАНСПОЗИЦИИ МДГ4.
.3.3. V ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА
КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ТРАНСПОЗИЦИЙ МДГ4.
П.4. АКТИВНАЯ И НЕАКТИВНАЯ КОПИИ МДГ4.
П.4.1. СРАВНЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ И АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДВУХ ВАРИАНТОВ
КЛОНИРОВАННЫХ КОПИЙ МДГ4.
П.4.2. СРАВНЕНИЕ ТРАНСПОЗИЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГИБРИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ КОМБИНАЦИИ УЧАСТКОВ АКТИВНОГО И НЕАКТИВНОГО
ГП. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ш.1. ЛИНИИ I , ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ.
Ш.2. ПЛАЗМИДЫ И ШТАММЫ .1,, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ.
Ш.З. РЕАКТИВЫ
Ш.4. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ
III.5. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК.
Ш.5.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ МУХ.
.5.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДЮЙ ДНК.
т.6. ТРАНСФОРМАЦИЯ КОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК .I ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.
ТП.6.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.
1.6.2. ТРАНСФОРМАЦИЯ
Ш.7. РЕСТРИКЦИЯ ДНК.
Ш.7.1. РЕСТРИКЦИЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.
Ш.7.2. РЕСТРИКЦИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ МУХ.
Ш.8. САУЗЕРНБЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ.
Ш.8.1. ПЕРЕНОС ДНК НА НЕЙЛОНОВЫЕ ФИЛЬТРЫ.
Ш.8.2. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК ИЗ АГАРОЗНОГО
ГЕЛЯ С ПОМОЩЬЮ I XI
I.
.8.3. МЕЧЕНИЕ ДНКЗОНДА МЕТОДОМ РАССЕЯННОЙ
ЗАТРАВКИ.
II.8.4. ГИБРИДИЗАЦИЯ.
П1.9. V.
I.9.1. ОДНОЭТАПНЫЙ V.
1.9.2. ДВУХЭТАПНЫЙ V.
I. . КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТА КОНСТРУКЦИИ рбК I.
1. .1. ПОД1 ОТОВКА ФРАГМЕНТА ДЛЯ ЛИГИРОВАНИЯ.
I. .2. ПОДГОТОВКА ВЕКТОРА К ЛИГИРОВАНИЮ.
III. .2.1. ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВЕКТОРА.
III. .3. ЛИГИРОВАНИЕ.
Ш. . ГИБРИДИЗАЦИЯ I I ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ИЗ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ ДРОЗОФИЛЫ С БИОТИНЛИРОВАННЫМ ДНКЗОНДОМ.
т. .1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПОЛИТЕННЫХ
ХРОМОСОМ.
III. .2. ВВЕДЕНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННОЙ МЕТКИ В
ПРЕПАРАТЫ ДНК НИК ТРАНСЛЯЦИЯ.
Ш3. ГИБРИДИЗАЦИЯ.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ IV. 1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДВУХ ВАРИАНТОВ МДГ4 В ЛИНИЯХ
.
IV.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КОПИЙ МДГ4 В КАЖДОЙ ЛИНИИ.
IV.3. ВЫЯВЛЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА
ПЕРЕМЕЩЕНИЯ МДГ4 С ПОМОЩЬЮ V.
IV.4. ЛОКАЛИЗАЦИЯ МДГ4 НА ХРОМОСОМАХ ЛИНИЙ

V. ОБСУЖДЕНИЕ
V. 1. МДГ4 И ЭВОЛЮЦИЯ.
V.I.I. ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ДВУХ
ПОДСЕМЕЙСТВ МДГ4.
V.I.2. КОЭВОЛЮЦИЯ ГЕНА И МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА
V.2. ПОИСК МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПЕРЕМЕЩЕ1 МЙ МДГ4.
У.2Л. АЛЛЕЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ.
V.2.2. НЕИЗМЕННОСТЬ ГЕНОМНОГО ОКРУЖЕНИЯ МДГ4 В ЛИНИЯХ С БОЛЬШИМ ЧИСЛОМ КОПИЙ ЭЛЕМЕНТА. г.2.3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ МДГ4 НА ХРОМОСОМАХ ЛИНИЙ
О. 4.
VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VII. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ПОИСК МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПЕРЕМЕЩЕ1 МЙ МДГ4. У.2Л. АЛЛЕЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ. V.2. НЕИЗМЕННОСТЬ ГЕНОМНОГО ОКРУЖЕНИЯ МДГ4 В ЛИНИЯХ С БОЛЬШИМ ЧИСЛОМ КОПИЙ ЭЛЕМЕНТА. О. 4. VI. VII. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ. Об. Тыс. Т.п. Мобильные генетические элементы МГЭ являются составной частью генетического аппарата высших организмов Хесин, . Нарушая консервативность эукариотического генома, они обеспечивают подвижность, необходимую для успешной адаптации особей к изменениям, происходящим в среде обитания. У i на долю МГЭ приходится около ДНК ii . Б процессе эволюции установлен сложный характер взаимодействия МГЭ с хозяйскими генами. С одной стороны, мобильные элементы, встраиваясь в различные участки генов, в большей или меньшей степени влияют на их экспрессию к , V. Ь. С другой стороны, в клетке существуют контролирующие механизмы, подавляющие транспозиц ию, не давая ей достигнуть уровня, опасного для жизни особи. Последние годы активно изучается мобильный элемент . МДГ4, именуемый в зарубежной литературе . Особенности его структуры и инфекционные свойства позволяют говорить о МДГ4 как о первом ретровирусе беспозвоночных, обнаруженным на сегодняшний день i . Подобно ретровирусам, цикл его транспозиции проходит через стадию обратной транскрипции iv . МДГ4 имеет сложную структуру и содержит в своем составе промотор, энхансер, сигнал полиаденилирования, а также инсулятор . Встраивание же элемента в кодирующую часть гена обычно приводит к полной потере генной функции. Несмотря на то, что ретровирусы были предметом пристального внимания исследователей, на данный момент очень мало сведений об их генетической связи с хозяином. Это обусловлено тем, что в роли хозяина выступали позвоночные трудные объекты для генетического анализа. Появление ретротранспозона МДГ4 в геноме такого удобного объектакак . Спонтанные транспозиции мобильных элементов, как правило, происходят чрезвычайно редко с частотой примерно 6 перемещений на гамету за поколение, но в некоторых системах перемещения наблюдаются с повышенной частотой. Одна из таких систем генетической нестабильности линия i была описана А. И. Кимом. Эта нестабильная мутаторная линия МЛ характеризуется продолженной нестабильностью увеличенной до 3 4 частотой спонтанного мутирования, нестабильным характером мутаций и активными, независимыми друг от друга перемещениями двух МГЭ МДГ4 и i . Кт, v, . Молекулярный анализ МДГ4, клонированного из мух как мутаторной линии , так и исходной для нес стабильной линии i, выявил существование двух подсемейств регротранспозона, имеющих четкие структурные различия. Эти два подсемейства были условно названы активным и неактивным. Наличие некоторых сайтов рестрикции характерно для активной копии, в то время как по другим наблюдается полиморфизм, то есть они могут встречаться как в активной, так и в неактивной копиях i , . В недавних работах было показано, что генетическая нестабильность в линии обусловлена не только присутствием в геноме активного подсемейства МДГ4. Необходимо также наличие мутации в клеточном гене , контролирующем частоту транспозиций i . Линии, подобные , могут служить хорошей моделью для дальнейшего изучения механизмов регуляции рстротранспозиции. Актуальность этого вопроса вызвана явным сходством МДГ4 с ретровирусами позвоночных и, следовательно, возможностью экстраполяции полученных результатов на системы паразит хозяин, существующие у более высокоразвитых организмов. Особый фундаментальный интерес представляет исследование эволюционных связей двух вариантов МДГ4, а также коэволюции ретротранспозонов и клеточных генов. Освещение проблемы происхождения и развития МГЭ приблизит нас к пониманию закономерностей сосуществования и взаимодействия клетки с вирусоподобными элементами. Исследовать особенности распределения двух вариантов МДГ4 в линиях . Выявить генетически нестабильные линии с помощью генетического теста на транспозиционную активность. Определить число копий и локализацию МДГ4 на хромосомах линий .