Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей Saccharomyces Cerevisiae

• Автор: Москаленко, Светлана Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 129 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МЕХАНИЗМЫ,

РЕГУЛИРУЮЩИЕ ТОЧНОСТЬ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

1.1. Терминация трансляции

1.1.1. Стопкодоны

1.1.2. Декодирование стопкодона.

1.1.3. Прокариотические факторы терминации трансляции

1.1.4. Эукариотические факторы терминации трансляции.

1.2. Принцип неоднозначности терминации трансляции.

1.3. Факторы, модифицирующие эффективность терминации трансляции.
1.3.1 Влияние контекста на эффективность терминации трансляции
1.3.2. Частичная инактивация факторов терминации трансляции у дрожжей
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы
2.2. Среды и условия культивирования.
2.3. Плазмиды
2.4. Генетические методы.
2.4.1. Получение мутантов ьир
2.4.2. Количественная оценка стабильности плазмид
2.4.3. Изменение типа спаривания.
2.5. Молекулярнобиологические и биохимические методы
2.5.1. Количественная характеристика нонсенссупрессии у мутантов ир.
2.5.2. Секвенирование.
2.5.3. Получение штамма 1ОТ, содержащего дизрупцию гена 1Р
2.5.4. Конструирование плазмид
2.5.4. Замена стонкодона 1ЮА на иАв в мутантной аллели I.
2.5.5. Нозернгибридизация
2.5.6. Иммуноблотинг
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Получение коллекции нонсенс и миссенсмутантов по гену
3.2. Характеристика фенотипа полученных мутантов
3.3. Секвенирование мутантных аллелей и аллели дикого тина гена ЗиР .
3.4. Количественная оценка нонсенссупрессии у мутантов ир.
3.5. Количественный анализ белков еМТ и еИЕЗ у мутантов эир.
3.6. Анализ взаимодействия мутантных белков еИП с еКЬЗ дикого типа в двугибридной системе.
3.7. Влияние генотипического фона на проявление мутаций ьирп.
3.7.1. Замещение аллели дикого типа гена 5Р на аллели с нонсенсмутацией .
3.7.2. Влияние генотипического фона на проявление миссенсмутаций
в гене 7Р.
3.7.3. Характеристика уровня белков . и еЯКЗ у штамма 1А1СТ рКБЗ зир4 5п
3.8. Поиск возможных механизмов осмысления стопкодона, возникшего мутационным путем в кодирующей последовательности гена ЗиР
3.8.1. Влияние нуклеотида в положении 4 на эффективность терминации трансляции.
3.8.2. Частота потери плазмиды, несущей аллель дикого типа гена 5ТР при повторном замещении.
3.8.3. Нонсенсмутации в гене ЖР снижают выживаемость аскоспор.
3.8.4. Сравнение выживаемости аскоспор, несущих мутантные аллели ирп у диплоидов, гетеро и гомозиготных по дизрупции гена ЗиР
3.8.5. Увеличение выживаемости аскоспор в присутствии 15.
3.8.6. Сравнение уровня потенциально супрессорных тРНК в штамме 1БД и его производных с нонсенсмутацией в гене 8ПР.
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Омнипотентные супрессорные мутации в этих генах активно используются при анализе механизмов терминации трансляции у дрожжей . ИнгеВечтомов, . . vii. и , кодирующих факторы терминации трансляции 2 и 3, соответственно, возможно возникновение нонсенсмутаций i , . . Такие мутации, не являясь летальными, приводят к нарушению терминации трансляции. Нонсенсмутации в гене , кодирующем . , считались летальными в отсутствие мутантной супрессорной тРНК, способной транслировать нонсенскодон i . В ходе данной работы были впервые получены жизнеспособные штаммы с нонсенсмутациями в гене . Исследования подобных нонсенсмутаций позволяют расширить наши представления о лабильности живых систем, а также являются моделью для изучения механизмов, компенсирующих нонсенсмутации в жизненноважных генах. В работе были получены также миссенсмутанты по гену . Изучение проявления миссенсмутаций в гене , приводящих к аминокислотным заменам в белке , вносит существенный вклад в идентификацию участка, отвечающего за узнавание стопкодонов фактором терминации . ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Еще совсем недавно считалось, что контроль на уровне транскрипции является основным механизмом регуляции точности реализации генетической информации. При этом регуляции на уровне трансляции отводилась лишь вспомогательная роль. Однако за последнее время было обнаружено огромное количество фактов, свидетельствующих о вкладе трансляционной регуляции в обеспечение жизнедеятельности организма. Регуляция синтеза белка необходима для поддержания внутриклеточного баланса, а также для изменения этого баланса в меняющихся условиях окружающей или внутренней среды организма. Сравнение прокариотических и эукариотических объектов указывает на существование универсальных механизмов поддержания точности трансляции, опосредованных рибосомными белками, рРНК, тРНК и факторами трансляции. Данный обзор посвящен механизмам, которые обеспечивают терминацию белкового синтеза у прокариот и эукариот. Также, будут рассмотрены причины, приводящие к осмыслению стопкодона, возникшего мутационным путем в кодирующей последовательности гена как примера неоднозначности в реализации генетической информации на стадии терминации трансляции. Согласно универсальному генетическому коду, три кодона , и , являются естественными сигналами терминации. Использование этих стопкодонов в качестве терминирующих сигналов не является равномерным среди различных генов. Так, у . в каждом втором гене, реже стопкодон в каждом третьем гене. Наиболее редко встречается стопкодон в одном из десяти генов см. . Однако в настоящее время получены многочисленные подтверждения того, что генетический код не является универсальным. Так, стопкодон в мРНК митохондрий грибов, насекомых и млекопитающих является значащим и кодирует триптофан i . i . Также, стопкодон кодирует триптофан и у бактерии . . Ii . У . кодирует цистеин . В то же время, у простейших i . . сохранил функцию терминатора, тогда как кодоны и являются значащими и кодируют глутамин , , . Для каждого из перечисленных примеров была обнаружена специфическая тРИК, которая присутствует у данных организмов и обеспечивает трансляцию кодонов, являющихся терминирующими согласно универсальному генетическому коду. Следует отметить, что антикодон такой тРНК может быть либо полностью комплементарен стопкодону, либо кодонантикодоновое взаимодействие происходит за счет образования неканонических пар. . за счет образования пары i . Также, некоторые белки у прокариот, эукариот и архебактерий содержат аминокислоту селеноцистеин, которая кодируется кодоном см. Тате . Считывание кодона в этом случае происходит за счет , которая представляет собой модифицированную на посттранскрипционном уровне сериновую тРНК.