Создание новой TyA-опосредованной системы экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Марченко, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Транспозон дрожжей Ту

1.1. История открытия Ту транспозонов и их роль в формировании генома

дрожжей.

1.2. Строение транспозона Ту 1.

1.3. Протеолитический процессинг белков транспозона Ту 1 и морфогенез

вирусоподобных частиц

1.4. Морфология вирусоподобных частиц транспозона Ту

1.5. Организация белковых субъединиц в составе вирусоподобных частиц.

1.6. Упаковка II вирусоподобной частицей

1.7. Разнообразие Ту 1 элементов
1.8. Эволюция Ту элементов дрожжей vii.
1.9. Регуляция транскрипции Ту
1 активация структурных генов транспозоном Гу
ГЛАВА 2. ГИБРИДНЫЕ ВПЧ
2.1. Создание и использование гибридных ВПЧ.
2.2. Структура гибридных ВПЧ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы микроорганизмов.
2. Плазмиды и гены
3. Среды для культивирования дрожжей
4. Среды и условия культивирования .i.
5. Условия культивирования дрожжей
6. Трансформация клеток . vii и .i
7. Манипуляции с плазмидной ДНК.
8. Ферменты, использованные в молекулярном клонировании.
9. Сайтнаправленный мутагенез и секвенирование ДНК.
. Синтетические праймеры и линкеры
. Синтетические пептиды.
. Определение концентрации белка
. Электрофорез белков в ПААГгслях
. Выделение суммарной клеточной ДНК дрожжей.
. Выделение суммарной клеточной РНК дрожжей.
. Анализ продукции и очистка ВПЧ
. Выделение РНК из вирусоподобных частиц
. Анализ РНК по Нозерну.
. Анализ ДНК по Саузерну
. Иммунноферментный анализ
.1. Получение антисывороток.
.2. Стандартный ИФА.
.3. Модифицированный ИФА
.4. Демонстрация взаимодействия ВПЧЛДУн с ЫРЫу
.5. Количественная оценка взаимодействия ВПЧУьУц с ЫРЫу в
растворе.
. Условные обозначения при описании процедур конструирования
. Конструирование векторов и фрагментов ДНК.
. Электронная микроскопия.
. Конструирование штаммов дрожжей.
. Анализ фосфорилирования белка р
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выбор оптимального варианта гена ТуА для создания системы продукции
гибридных вирусоподобных частиц.
2. Упаковка РНК в вирусоподобную частицу
3. Гибридный белок р , содержащий Ыконцсвыс гстсрологичныс эпитопы способен к самосборке в ВПЧ.
4. Создание бивалентных гибридных ВПЧ.
4.1. Формирование бивалентных ВПЧ белком р, несущим одновременно различные и Сконцевые эпитопы.
4.2. Формирование бивалентных ВПЧ в клетке при коэкспрессии двух разных гибридных р белков.
4.3. Использование принципа статистической самосборки вирусоподобных
частиц из общего пула белка р1 для объединения вариабельных доменов
антитела
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ
ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
а.к. аминокислотный остаток
ВИЧ вирус иммуннодефицита человека
ВПЧ вирусоподобная частица
ВПЧУ.УН вирусоподобная частица, содержащая гибридный белок р 1,
несущий фрагмент антитела к ЫБИу
ДСН додецилсульфат натрия
ЗФБ зеленый флуоресцирующий белок
ПААГ полиакриламидный гель
п.о. пар оснований
т.о. тысяч оснований
т.п.о. тысяч пар оснований
ЫРЫу интерферон гамма человека
Ы длинные концевые повторы
ТуРНК мРНК, кодируемая геном ТуА
ВВЕДЕНИЕ


В связи с вышесказанным определены цели работы сравнить различные природные варианты гена ТуА с точки зрения эффективности образования вирусоподобных частиц, установить закономерности формирования гибридных ВПЧ и продемонстрировать новые возможности использования этой системы экспрессии. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТРАНСПОЗОН ДРОЖЖЕЙ Ту1. История открытия Ту транспозонов и их роль в формировании генома дрожжей. Транспозоны последовательности ДНК, меняющие свое положение в геноме со значительно более высокой частотой, чем это характерно для основной массы клеточной ДНК. Мобильные генетические элементы были впервые описаны у кукурузы 1,2, затем их обнаружили и у многих других организмов. Молекулярная структура транспозонов была детально изучена в таких различных организмах как бактерии, дрожжи, плодовые мушки ,,, 2. Первый мигрирующий элемент, обнаруженный в дрожжах vii, был назван Ту 1 от в работе Камерона с соавт. Ту 1 был описан исследователями как умеренно повторяющаяся последовательность ДНК, одна из копий которой присутствовала по соседству с геном, кодирующим тирозиновую тРНК, в штамме дрожжей 8 и отсутствовав в других штаммах. Анализ гибридизации этой последовательности с ДНК различных лабораторных штаммов дрожжей подтвердил, что положение Ту 1 в геноме варьирует от штамма к штамму. Прямые доказательства транспозиции Ту 1 были получены путем инкубации клеток дрожжей vii при С . В этих условиях частота транспозиции существенно увеличивается, что многократно упрощает наблюдения за перемещениями трансиозона по геному. Вскоре после этого, анализ мутаций гена 4 показал, что две нестабильные мутации i были вызваны интеграцией последовательности, гомологичной Ту1, перед этим геном 1. Ту1 в регуляторные районы этих генов. Такие генетические феномены, как делении, транслокации и инверсии в дрожжах i vii были также описаны, как связанные с Ту 1 подобными последовательностями , , 0, 3. Таким образом, транспозон Ту 1 являегся причиной многих изменений генома дрожжей, а, значит, играет важную роль в формировании его структуры . Транспозон дрожжей Ту 1 принадлежит к классу мобильных генетических элементов эукариот, называемому ретротранспозонами. Отличительная особенность ретротранспозопов транспозиция с участием РНКпосредника. К этому же классу мобильных генетических элементов принадлежат такие наиболее изученные представители, как i и подобные элементы i, I гены , элемент ii . Изучение ретротранспозопов выявило много структурных и функциональных черт, которые являются для них общими с провирусами ретровирусов 7. Однако, существенное отличие ретротранспозопов от ретровирусов заключается в том, что они не являются инфекционными и никогда не иокидаюл клсткухозяина. Среди Ту элементов . Ту1Ту5. В среднем, лабораторные штаммы дрожжей содержат порядка функциональных копий Ту 1 на гаплоидный геном, около копий Ту2 и единичные копии транспозонов других групп . Изучение природных штаммов дрожжей показало более значительные вариации в количестве Ту элементов на гаплоидный геном. Так, число наиболее широко представленных Ту 1 элементов может варьировать от 1 до . При этом не было найдено ни одного природного штамма из 9, не содержащего Ту 1 элементов 1. Строение транспозона . Наиболее широко представленный в геноме дрожжей vii гранспозон представляет собой последовательность ДНК длиной 5. Размер длинных прямых повторов транспозона составляет 5 п. Рисунок 1. Строение ретрогранспозона . Элемент Ту содержит две перекрывающиеся открытые рамки считывания Ту А и ТуВ , , 5. Открытая рамка считывания ТуА начинается с ЛТГ кодона внутри последовательности ЗЛЧ и имеет длину 1. Открытая рамка считывания ТуВ начинается с АЦА треонинового кодона, перекрываясь с ТуА на нуклеотидов, и продолжается почти до конца ЗЬТЯ . Таким образом, трансляция рамки считывания ТуВ сдвинута на 1 нуклеотид относительно ТуА. Открытая рамка считывания ТуА кодирует белок р1, аналогичный белкам ретровирусов, способный к самосборке в вирусоподобные частицы , 4. Открытая рамка считывания ТуВ определяетсин тез белков с ферментативными активностями протеазу РН, интегразу Ш, обратную транскриптазу Т и РНКазу Н ЯН 4, 5.