Новые экспериментальные подходы в изучении протеома человека и их использование для анализа продуктов генной экспрессии в кератиноцитах человека и для выявления новых генов

• Автор: Громов, Павел Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 216 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Двумерный электрофорез белков в ПААГ основной метод

анализа протеома.

1.1 Почему именно двумерный эелектрофорез в ПААГ .

1.2. Сколько белков может содержаться в анализируемом образце Протеомный комплемент эукариотической клетки

1.3. Современные технологии двумерного электрофореза в

ПААГ могут ли они быть усовершенствованы

1.4. Резервы улучшения способов приготовления образца для двумерного анализа и методов детекции белков на двумерных гелях.

ГЛАВА 2 Картирование и идентификация белков на двумерных гелях и

блотах
2.1 Элементы протеомных технологий.
2.2. Метод сопряженной i vi транскртщиитрансляции
2.3. Идентификация на двумерных гелях продук тов транзитной экспрессии к ДНК клонов в 1 клетках.
2.4. Идентификация на двумерных гелях блотах белков, составляющих отдельные функциональные семейства путем специфического связывания меченных лигандов.
2.4.1 Двумерное картирование Са связывающих белков.
2.4.2 Низкомолекулярные ОТРсвязываклцие белки
2.5. ЕСЬ иммунодетекция и проблема белков, представленных малым количеством копий
ГЛАВА 3 Двумерный анализ посттранссляционного процессинга и
химических модификаций первичных продуктов трансляции
3.1 Значение ко и поспрансляционных модификаций белков в протсомных проектах
3.2. Фосфорилирование
3.3 Гликозилирование.
3.4 Липидирование пальмитилирование и миристолирование
3.5 Изопренилирование фарнезилирование и геранилгеранилирование.
ГЛАВА 4. Двумерные карты и базы данных белковых продуктов генной
экспрессии в нормальных кератиноцитах человека.
4.1 Кератиноциты человека как модель изучения клеточной пролиферации и дифференцировки.
4.2 Создание двумерной карты и базы данных белков кератиноцитов человека. .
4.2.1 Получение некультивированных нефракционированных
эпидермальных кератиноцитов.
4.2.2 Культивирование нормальных кератиноцитов
4.2.3 Изотопное включение метионина в культивированные и некультивированные кератиноциты.
4.2.4 Двумерный электрофорез изоэлектрофокусирование,
ИЭФ, и фокусирование в неравновесном градиенте, ЫЕРНСЕ
4.2.5 Окраска гелей Кумасси ярко голубым и нитратом серебра.
4.2.6 Радиоавтография и флюорография.
4.2.7 Микросеквенирование
4.2.8 Масс спектрометрия
4.2.9 Экспрессия кД1 I клонов в системе вируса Vii
4.2. Компьютерный анализ двумерных изображенеий
4.3 Синтетические двумерные картыизображения белков кератиноцитов человека
4.4 Двумерные базы данных белков клеток, тканей и жидкостей человека расположенные е в глобальной сети Инге ренет i.iiIi.
ГЛАВА 5. Низкомолекулярные связывающие белки, эспрессирующиеся в нормальных пролиферирующих, дифференцированных и трансформированных кератиноцитах человека.
5.1 Двумерный профиль низкомолекулярных
связывающих белков кератиноцитов человека.
5.2 Динамика изменений экспрессии низкомолекулярных связывающих белков в нормальных пролиферирующих, дифференцированных и Утрансформированных К кератиноцитах человека
5.3 Новая стратегия для молекулярногобиологического
клонирования низкомолекулярных связывающих белков
ГЛАВА 6. Новые гены человека.
6.1 новый низкомолекулярный связьюающий белок, представляющий новую подгруппу госуперсемейства
6.1.1 Клонирование, секвенированис и анализ первичной
структуры .
6.1.2 Дифференциальная экспрессия гена в нормальных и
трансформированных клетках человека
6.1.3 Саузсрнанализ и хромосомное картирование гена.
6.1.4 азная активност .
6.1.5 Анализ посттрансляционных модификаций .
6.2 низкомолекуярный связывающий белок из семейства белков, регулирующих внутриклеточный транспорт
6.2.1 транслируется с двух разных типов мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга.
6.2.2 Нозернблог анализ 1а.
6.2.3 Два вида мР I, кодирующие , транскрибируются с одного гена, локализующегося на .3
6.2.4 Анализ i viv постгрансляционных модификаций .
6.2.5 Влияние гиперэкспрессии на уровни синте за некоторых низкомолекулярных связывающих
белков
6.3 Галектин 7 новый член семейства галактозосвязывающих
белков, галсктинов.
6.3.1 Идентификация на двумерной белковой карте и клонирование галектина 7
6.3.2 Галектин 7 представитель семейства лактозосвязывающих белков.
6.3.3 Хромосомное картирование галектина 7
ГЛАВА 7 Двумерные базы данных белков переходноклеточной карциномы уретелия мочевого пузыря ТСС и поиск маркеров метастазирования.
7.1 Рак эпителия стенки мочевого пузыря
7.2 Переходноклеточная карцинома ТСС
7.3 Двумерная карта и база данных белков, экспрессирующихся в ТСС.
7.4 новый белковый маркер злокачественного развития ТСС.
7.5 Экспрессия в ТСС на транскрипционном и трансляционном уровнях
Выводы
Список литературы


Различные современные модификации двумерного электрофореза позволяю а разделять белковые смеси на составляющие полипептидные компоненты до нескольких тысяч, б сравнивать белковые профили генной экспрессии в паре образцов например, нормальные и трансформированные клетки, клетки на разных стадиях роста иили дифференцировки и т. При этом все обнаруженные изменения в белках могут быть проанализированы как на качественном, так и на количественном уровне по отношению друг к другу. Указанная возможность проиллюстрирована на рис. ИЭФ белков кератиноцитов человека, меченных метионином На представленных радиоавтографах стрелками показаны некоторые белки, экспрессия которых значительно различается в парах нормальные кератиноциты V4 трансформированные кератиноциты Рис ЗА и ЗВ и нормальные кератиноциты нормальные кератиноциты плюс гамма интерферон. В частности резко увеличенный уровень циклина в трансформированной линии ясно отражает различия в скорости клеточной пролиферации. Подробнее двумерный анализ кератиноцитов человека и создание соответствующей белковой базы данных описано ниже см. Двумерные гели могут быть сканированы и проанализированы количественно с целью поиска различии в уровнях белков, индукции новых продуктов или идентификации корегулирусмых полипептидов. РвР 9
I а,. ЬпспИао ,Л чЛ1Л. РвР 9. Мг О. V . И 1 4. Рис. Белки, дифференциально экспрессирующиеся в представленных парах, показаны стрелками. Систематическое проведение подобных исследований позволяет хранить полученную информацию в двумерных базах данных и фиксировать какие гены и как регулируются при различных нормальных и патологических состояниях i. Многие результаты, приведенные в данной работе вошли в базы данных, созданные Датским Центром Изучения Генома Человека директор, профессор Х. Е. Целис. По мере того, как эти базы данных накапливают критическую информационную массу, они все более становятся важнейшим источником уникальной информации при исследованиях сигнальных путей и их компонентов, которые могут быть ключевыми в развитии болезни i . Эффективность применения двумерного электрофореза в протеомных проектах в значительной степени зависит от тшсла белков, которые должны быть разделены из многокомпонетной белковой смеси, например эукариотической клетки. В дрожжах, ссквеиирование генома которых недавно полностью завершено, общее число белков невидимому не превышает . В случае клеток человека, ситуация значительно более сложная, т. Опубликованы предварительные данные, иреднолагакнцие число генов у Н. Протсомные исследования, проведенные в нескольких лабораториях, включая результаты данной работы, указывают, что в любой клетке включена только отоносительно небольшая часть всех генов, составляющих полный геном организма i . Однако, к этому числу необходимо добавить многочисленные белковые варианты, образующиеся в результате посттрансляционного процесинга и различных химических модификаций фосфорилирование, гликозилирование, метилирование, ацетилирование, липидирование, сульфатирование и др. Около всех белков представляют продукты т. Принимая во внимание, что человеческий организм содержит по меньшей мере 0 раличнмх типов клеток, а в целом около генов . В течение двух десятилетий, начиная с момента изобретения, двумерный электрофорез в ПААГ проводился с помощью амфолиновносителей, формирующих градиент в процессе изоэлсктрофокусирования , О . Несмотря на несомненные значительные успехи достигнутые с помощью этого метода, бало установлено что эта технология очень трудоемка и требует определенного мастерства и навыка от исследователя. Кроме того обнаружилась проблема воспроизводимости результатов, получаемых в различных лабораториях, возникающая прежде всего изза неконтролируемых вариаций в партиях амфолинов, используемых для формирования градиента . Недавно, ситуация коренным образом изменилась с внедрением т. I vi . I обеспечивают значительно болсс воспроизводимые профили фокусирования и позволяют избежать некоторые проблемы, связанные с амфолинами, например, катионный дрейф . I имеют значительно большую емкость в отношении количества наносимого образца и позволяет разрешать полепептиды в очень узком граденте около 0, рНсм ii, i, .