Дизайн систем экспрессии для экспериментальных моделей с использованием трансгенных растений

• Автор: Мирахорли Неда
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы экспрессии чужеродных генов в растениях.

II. Экспрессионные растительные вектора на основе iплазм ид.

1Л .2.Экспрессионные вектора, полученные на основе растительных патогенов

1.1.3. Альтернативные системы экспрессии растений.

1.1.4. Пространственная и временная регуляция экспрессии генов в растениях. .

1.2. Дефензины растений.

1.2.1. Структура и классификация растительных дефензинов

1.2.2. Антимикробная и антигрибная активность дефензинов растений.

1.2.3. Возможности применения растительных дефензинов.

1.3. Репортерные системы для изучения различных аспектов регуляции экспрессии. . генов.
ГЛАВА Н. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Конструирование базовых экспрсссионных векторов для трансформации растений
3.2. Разработ ка количественного метода оценки уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растительных клетках
3.3. Сравнение результатов транзиентной и стабильной экспрессии репортерного гена термостабильной лихеназы в растениях
3.4. Дизайн систем экспрессии для целевого гена в растениях на модели модифицированного гена дефензина подсолнечника
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ПААГ ДСНПААГ гельэлектрофорез в денатурирующих условиях
ЭДТА этилендиамиитетраацстат
V промотор гена РНК вируса мозаики цветной капусты 2 модифицированный ген дефензина подсолнечника
последовательность аминокислот, обеспечивающая закрепление белка в эндоплазматическом ретикулуме рА обтсть полиаденилирования
а.о. аминокислотные остатки
i2 делеционный вариан т лихеназы ii
ДСН додецилсульфат натрия
ПЦР полимеразная цепная реакция
ИУК индолилуксусная кислота
среда МурасигеСкуга
ноли участок аминокислотной последовательности, состоящий из аланина
РЕО полиэтилеиоксид
глюкуронидаза . i
зеленый флюоресцентный белок vii
ДНС динитросалициловый реагент.
ВВЕДЕНИЕ


Голод вот что грозиг населению Земли, если прирост получаемого урожая на квадратный метр земли не будет коррелировать с приростом населения на планете. На качественно новый уровень решения этой задачи вышли ученые в начале х годов века. Разработка новой системы селекции хозяйственно полезных признаков, путем введения в клетки высших растений чужеродных генов, дала мощный толчок к развитию новой научной отрасли биотехнологии. Стало возможно создание растений с заранее заданными свойствами, в том числе и с повышенной продуктивностью, вследствие устойчивости к многим абиотическим и биотическим факторам окружающей среды. Импульсом к развитию метода переноса чужеродных снов в растения явились результаты детального молскулярногенетического исследования механизма индукции опухолеобразования у растений к вирулентным агробактериям как выяснилось в результате этих исследований, онухолсобразующие ТО плазмиды агробактсрий представляют собой природную векторную систему, которую можно модифицировать с целью осуществления экспериментального переноса новых генов в растения. Пирузяп Э. С.,. С тех пор прошло почти тридцать лег и получена не одна тысяча генетически модифицированных растений, которые нашли применение не только в сельском хозяйстве, но и в медицине и других отраслях. Экспрессионные растительные вектора на основе Тплашид. Несмотря на продолжающиеся поиски новых путей внедрения чужеродных генов в геном растений и изучения их экспрессии, Тшазмидная система остается наиболее эффективной. Н.Р. Данная система позволила экспрессировать в растениях табака целый ряд бактериальных генов е целью создания моделей для функциональной геномики ii . Л ii i, для изучения механизмов устойчивости к абиотическим стрессам. Двумя основными составляющими для всех iплазмид, используемых для создания векторов, являются ГДНК и область вирулентности. ГДНК, как дискретный фрагмент iплазм иды, обрамлена короткими повторами длиной в пар оснований, известными как правый и левый бордер. Целевые гены, которые необходимо перенести в растение, всегда располагаются между и повторами i вектора i . Кроме того, в область ТДНК включается также селективный маркерный ген, кодирующий резистентность к антибиотику или гербициду, промотор, экспрессируемый в растениях, уникальные сайты рестрикции. Процессинг ТДНК и перенос е в клеточное ядро хозяйской растительной клетки достигается согласованным действием около viбслков, кодируемых соответствующими viгенами, локализованными вне 1области iплазмиды Пирузян Э. С., Андрианов В. А, Пирузян Э. С.,. Наибольшей, популярностью для переноса генетической информации в растения пользуются бинарные iвектора. Данные вектора способны реплицироваться одновременно как в клетках ii i, так и в клетках i i v,1. В данной системе векторов используется конфигурация ТДНК и viфупкций вместо нормальной iконфигурации этих функций в i плазмиде . ТДНК на релликоне дикого типа круга хозяев. Штамм . Векторные системы на основе iплазмид i i продолжают совершенствоваться. Одной из наиболее эффективных новых систем выступает система , как многосторонняя и гибкая бинарная iвекторная система для агробактериальной трансформации растений . Эта плазмидная система допускает любые аранжировки селектируемых маркерных и репортерных генов на правой или левой границах ТДНК. Полилинкер для клонирования взят из хорошо известной векторной системы i i, , . Кроме того, содержит iрегионрСо1Е1 для репликации в клетках ii i. Размеры и копийность плазмиды способствуют высокой эффекгивности протекания рекомбинационных процессов i vi. Исходный вектор не содержит селектируемых маркерных или репоргерггых геггов для трансформации растений. Находящиеся непосредственно по краям ТДНК и повторы содержат уникальные Нра и Iсайты для инсерции маркерных или репортериых геггов, слитых с промоторами и фланкируемых ЕсоКVсайтами. Четыре селективных маркерных гена, , , и , и два репортерных гена, и , были модифицированы с помощью сайтнаправлснного мутагенеза, чтобы удалить все рестрикционные сайты для клонирования в плазмиде .