Молекулярно-генетические эффекты единичных нуклеотидных замен в интроне 6 гена триптофандиоксигеназы человека и мыши

• Автор: Васильев, Геннадий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Фермент триптофаноксигеназа

1.1.1. Структура гена и регуляция его экспрессии

1.2. Роль триптофаноксигеназы в развитии психических расстройств

1.2.1. Ассоциация между развитием определенных психических расстройств и полиморфизмом гена

1.3. Полиморфизм генов в популяции человека

1.3.1. в кодирующих последовательностях генов человека

1.3.2. в некодирующих последовательностях генов человека

1.3.3. Неслучайный характер фиксации в некодирующих районах генов

1.4. Транскрипционные факторы 1 и 6
1.5. Транскрипционный фактор 1
1.4.2. Транскрипционный фактор 6
2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Линии животных
2.4. Приготовление экстракта ядер клеток печени
2.5. Метод торможения ДНКпробы в геле
2.6. Вестернблот анализ
2.7. Окраска белков красителем
2.8. Определение активности триптофаноксигеназы и тирозинаминотрансфсразы
2.9. Выделение геномной ДНК
2 Выделение продуктов ПЦР из агарозных гелей
2 Определение нуклеотидных последовательностей ДНК
3. Результаты
3.1. Изучение связывания транскрипционных факторов с различными вариантами района 1 0 и.о. интрона 6 гена человека
3.2. Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом
3.3. Определение базального уровня активности триптофаноксигеназы у полярных по моделям поведения линий мышей
3.4. Обнаружение в районе интрона 6 гена у контрастных по моделям поведения линий мышей
3.5. Идентификация белков, связывающихся с в интроне
гена мыши
4. Выводы
5. Список цитированной литературы
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДНКаза I дезоксирибонуклеаза
мРНК информационная матричная РНК
а.о. аминокислотные остатки
п.н. пар нуклеотидов
ПААТ полиакриламидный гель
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР полимеразная цепная реакция РНКаза А, Н рибонуклеаза А, Н
РТПЦР полимеразная цепная реакция продуктов реакции обратной транскрипции тРНК транспортная РНК ЕДТА этилендиаминтетрауксусная кислота АРОЕ аполипопротеин Е
САТконструкция эукариотический вектор, экспрессирующий ген хлорамфенколацетил трансферазы 1, 2, 3 рецепторы дофамина , 2, 3.
система фотодетекции иммобилизованного антигена с использованием коньюгата пероксидазаантитело и люминола 2 серотониновый рецептор 2А К килодальтон
инсулиннезависимый диабет взрослых РАН фенил аланингидроксилаза додецилсульфат натрия
единичные нуклеотидные замены i i i триптофан2,3диоксигеназа фактор некроза опухолей ТРИ триптофангидроксилаза
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Фермент триптофаноксигеназа человека является одним из ключевых звеньев в цепи биосинтеза нейромедиатора серотонина. Поэтому ген часто рассматривается как один из геновкандидатов на связь с различными нарушениями поведения предрасположенностью к шизофрении и алкоголизму . В частности, установлена статистически достоверная ассоциация между двумя в гене человека в позициях 3 п. Туретта, предрасположенность к наркотической, алкогольной зависимости и патологической склонностью к азартным играм. Данные являются примером вдвойне сложной для изучения ситуации, поскольку влияют на развитие полигенного признака i . Последнее обстоятельство дало нам возможность предположить, что мы имеем дело с так называемыми регуляторными , расположенными в регуляторной зоне гена и влияющими на его экспрессию за счт изменения в связывании с данным районом регуляторных ядерных белков. А в позиции 3 п. БЫР в районе интрона 6 у нескольких линий мышей, определение связывающихся с районами ядсрных белков и поиск корреляций между БИР, изменениями спектра связывающихся белков и признаком предрасположенностиустойчивости к развитию алкоголизма. Показано, что всем трем обнаруженным в популяциях человека аллелям гена Т2 присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Основной связывающийся с наиболее распространнным аллелем УТ белок идентифицирован как транскрипционный фактор УУ1. Обнаружено, что в случае мононуклеотидной замены вА в позиции 3 п. УУ1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных нами белков. Замена вТ в позиции 6 п. УУ1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора вАТАб, что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена Т2. В результате определения нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена ТО для шести линий мышей обнаружено пять 8ЫР и одна микроделеция. Из них три БИР приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами. Изучена активность ТТЮ2 в печени шести линий мышей. Не установлено связи между уровнем активности Т2 в печени мышей и признаком предрасположенностиустойчивости к развитию алкоголизма. Таким образом, в отличие от человека, не обнаружен вклад в формирование алкогольной зависимости у линии мышей . Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИциГ, на XIII всероссийском симпозиуме Структура и функции клеточного ядра Пущино, , и на международных конференциях Применение информационных технологий к проблемам биоразнообразия и динамики экосистем Северной Евразии Новосибирск, ii iii i vii, i v i vii. Iv vv Ii i . По теме диссертации опубликовано 7 статей. Рис. У человека обеспечивает окисление около триптофана, подвергающегося катаболической деградации ii, . Поэтому является основным ферментом, регулирующим уровень этой аминокислоты в плазме крови. Активность фермента в печени крыс обнаруживается через 2 недели после рождения, и достигает уровня, характерного для взрослых животных, через недель. Однако, на уровне отдельных клеток экспрессия регистрируется в ряде полностью дифференцированных гепатоцитов уже на следующий день после рождения . Экспрессия обнаруживается в культуре первичных гепатоцитов, хотя быстро снижается при длительном культивировании . Однако, в работе Хабера . ПЦР было показано, что мРНК гена кроме печени присутствует в мозге грызунов. РНК была детектирована в коре, мозжечке, гипоталамусе. Ранее наличие ферментативной активности в мозге, о которой сообщалось в работе Гала , , было сочтено ошибочным, поскольку применнная им методика не позволяла разделить активности ферментов и индолиламин 2,3диоксигеназы . Тем не менее, в свете новых данных кажется весьма вероятным заключение, что , кроме печени, экспрессируется также в мозге. Экспрессия находится под гормональным контролем индуцируется глюкокортикоидами, катехоламинами, глюкагоном и подавляется инсулином . СТРУКТУРА ГЕНА И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ. Ген локализован на хромосоме 4 у человека, 2 у крысы и у на хромосоме 3 мыши. Как у крысы i .