Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков

• Автор: Падкина, Марина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 394 с. : ил.

1.2.2.4. Промоторы генов РЕХ8, .

3.2.4.3. Влияние рекомбинантного РИФН и мутаций в гене РН5 на

3.3.5. Создание штаммов дрожжей ii i, синтезирующих и секретирующих аИФН человека

3.3.5.1. Создание вектора экспрессии I.

3.3.5.2. Получение штаммапродуцента аИФН человека и оценка его продуктивности

3.3.6. Создание штаммов дрожжей ii i, синтезирующих и секретирующих уИФН быка

3.3.6.1. Создание вектора экспрессии I9I.

3.3.6.2. Получение штаммапродуцента уИФН быка и оценка его продуктивности

3.3.7. Создание штаммов дрожжей ii i, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление уИФН быка.
3.3.8. Создание штаммов дрожжей ii i, синтезирующих и секретирующих интерлейкин2 человека
3.3.9. Оптимизация условий культивирования штаммовпродуцентов рекомбинантных секреторных интерферонов.
3.3 Разработка схемы очистки рекомбинантных аИФН и рИФН человека, секретируемых клетками дрожжей ii i
3.4. Создание штаммов дрожжей ii i продуцентов смнтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы
3.4.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б.
3.4.2. Получение интегрантов дрожжей ii i, содержащих в геноме ген X1 и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б
3.4.3. Получение штаммов дрожжей ii i, секретирующих рекомбинантный синтаксин Б
3.5. Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В, под контролем промотора гена АОХ1.
3.5.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного и серотипов
3.5.2. Получение штаммов дрожжей ii i, секретирующих рекомбинантный .
3.5.3. Получение штамма дрожжей ii i, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного .
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного
гена на уровень продукции гетерологичных белков.
Влияние структуры лидерной области мРНК и присутствия редких
кодонов на продукцию гетерологичных белков
Посттрансляционная модификация гетерологичных белков
Влияние особенностей метаболизма дрожжей . vii и . i
на фолдинг рекомбинантных белков
Стабильность гетерологичных белков
Влияние гетерологичных белков на жизнедеятельность клетки дрожжей
Секреция гетерологичных белков
Продукция синтаксина Б и
Оптимизация условий культивирования штаммовпродуцентов
Выделение и очистка гетерологичных белков.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список использованных


Тем не менее, суперпродукция 4 не позволяет значительно повысить выход чужеродного белка. Кроме того, увеличение количества белка активатора небезразлично для клетки и приводит к снижению скорости роста . Известно, что 4, активируя транскрипцию генов, взаимодействует с ТВР ТАТАсвязывающим белком, с коактиваторами транскрипции 2 и . ДНКгеликазой . Плейотропный эффект суперпродукции белка активатора, возможно, обусловлен тем, что, присутствуя в клетке в высокой концентрации, он оттитровывает значительное количество компонентов транскрипционного комплекса, что может приводить к нарушению транскрипции других генов. С другой стороны, существуют данные о том, что одновременное повышение уровня 4, и 3 с сохранением стехиометрических соотношений не нарушает регуляцию транскрипции , практически не влияет на рост клеток и увеличивает в раз продукцию галактозидазы . Возможно, что именно строгое соотношение позитивных и негативных регуляторов является необходимым условием эффективной активации транскрипции ,. Нельзя не упомянуть существование еще одного возможного пути повышения уровня экспрессии чужеродных генов. Лгенов. Использование промотора, содержащего для 4, ТАТАбокс и начало инициации транскрипции 3 3 промотора, оказалось успешным для продукции уинтерферона человека, токсичного для клеток дрожжей. Уровень уинтерфероновой матричной РНК был в раз выше, чем в случае 3 3 промотора i . Подобные результаты были получены и для эритропоэтина человека i, . Но, к сожалению, остается неизвестным, какую продукцию уинтерферона и эритропоэтина человека может обеспечить нативный 4. Возможно, что повышение уровня рекомбинантных белков определялось не эффективностью работы гибридного промотора, а возможностью регуляции экспрессии клонированных генов и связанного с этим значительного увеличения числа копий рекомбинантной плазмиды в клетке. Строгая регуляция транскрипции генов, а также быстрая и эффективная индукция их экспрессии делают промотор гена 1 одним из наиболее часто используемых регулируемых промоторов для гетерологичной экспрессии в дрожжах. Не менее популярным является промотор гена РН, структурного гена кислой фосфатазы 2 дрожжей. Кислые фосфатазы КФ 3. Краснопевцева и др. Краснопсвцева и др. Кислые фосфатазы являются экзоферментами и секретируются в процессе роста клеток в периплазматическое пространство и на поверхность клеточной оболочки Падкина и др. Уразманова и др. Кф2 синтезируется только при отсутствии неорганического фосфата Падкина и др. В условиях дерепрессии активность Кф2 возрастает, по меньшей мере, в 0 раз, содержание фермента может достигать 1 от суммарного клеточного белка . Регуляция экспрессии гена РН находится под сложным генетическим контролем, включающим факторы как позитивного, так и негативного контроля Кожин и Самсонова, Самсонова и др. Самсонова и др. Самбук, i . К позитивным регуляторам относятся белки, кодируемые генами РН, РН, i, . Самбук и др. Самбук и др. РНО и , рис. Мутации в генах РН, РН, РН1 выражаются в отсутствии экспрессии гена РИ на среде без неорганического фосфата. Мутации в генах РНО, РН5 приводят к конститутивному синтезу Кф2. Рис. Схема регуляции биосинтеза репрессибельной Кф2 дрожжей. Белок 4 имеет молекулярную массу ,9 кДа i . В концевой области расположен активирующий домен, в центральной части участки взаимодействия с белком активатором 2 и с негативным регулятором . ДНКсвязывающий домен, содержащий спиральвитокспиральную структуру, находится в Сконцевой области . Обнаружена значительная степень гомологии ДНКсвязывающих доменов 4 и транскрипционных факторов млекопитающих семейство Мус белков, , 2, Е, которые связываются с ДНК в виде димера и узнают палиндромную последовательность x. Делеционный анализ промотора гена 5 выявил два сайта связывания белка, кодируемого геном РН 1 и 2 , V . Изучение структуры хроматина промотора гена 5 показало, что в неактивном состоянии в условиях репрессии регуляторная область гена содержит 4 нуклеосомы, которые закрывают 2, сайты связывания белка 2 и ТАТА бокс рис. ТАТАбокс

нуклеосома
7 6
Рис. Структура промотора гена РН V .