Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Шабельская, Светлана Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ.

1.1. Факторы терминации трансляции у прокариот.

1.2. Эукариотические факторы терминации трансляции

1.2.1. Факторы терминации трансляции первого класса еЯР

1.2.2. Факторы терминации трансляции второго класса еИРЗ

1.2.3. Белок Бир дрожжевой фактор еКРЗ

1.2.4. Р5 прионная форма еИРЗ У. сегеУ1Я1ае

1.3. Супрессия нонсенскодонов или принцип неоднозначности терминации трансляции.

1.3.1. Факторы, влияющие на эффективность нонсенссупрессии.

1.3.2. Частичная инактивация факторов терминации трансляции.

1.4. Белки, взаимодействующие с факторами терминации трансляции .
1.4.1. Комплекс еШг1 и еШЗ.
1.4.2. Взаимодействие факторов терминации трансляции с белками рП, р и ирВ
1.4.3. Взаимодействие еКРЗ с РаЫ
1.4.4. Взаимодействие еКР 1 и еЛРЗ с другими белками
Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы.
2.2. Плазмиды.
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Генетические методы
2.4.1. Получение мутантов по гену 8иР.
2.4.2. Замещение плазмид
2.5. Молекулярногенетические методы
2.5.1. Секвенирование.
2.6. Методы работы с РНК
2.7. Методы работы с белками
2.7.1. Получение белковых экстрактов
2.7.2. Получение антител, специфичных к
2.7.3. Иммунопреципитация.
2.7.4. Иммуноблотинг
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Получение мутантов по гену и анализ молекулярной природы полученных мутаций
3.1.1. Получение мутантов по гену .
3.1.2. Оценка содержания белка 3 у полученных мутантов.
3.1.3. Фенотипическая характеристика полученных мутантов
3.1.4. Молекулярная природа мутантных аллелей .
3.2. Изучение нонсенсмутаций . Возможные механизмы, обеспечивающие жизнеспособность штаммов, несущих нонсенсмутации в жизненноважном ген.
3.2.1. Нонсенсмутации способны поддерживать жизнеспособность штаммов в отсутствие мутантных супрессорных тРНК
3.2.2. Мутантная супрессорная тРНК 5 повышает жизнеспособность штаммов, несущих нонсенсмутации
3.2.3. Нуклеотидный контекст нонсенсмутаций , полученных в данной работе.
3.2.4. Изучение уровня эндогенных тРНК в штаммах, несущих мутации .
3.3. Анализ белков 3 и у нонсенс и миссенсмутантов
3.3.1. Анализ белка
3.3.2. Анализ содержания белка у мутантов
3.3.3. Миссенсмутации , полученные в работе а также мутация 7, не нарушают взаимодействие белков 3 и .
3.4. Процесс деградации мРНК, содержащих нонсенсмутации , нарушен у мутантов и
3.4.1. Анализ содержания мРНК у мутантов
3.4.2. Ссквенирование мутантных аллелей i7I, I9 и .
3.4.3. мРНК i7 является субстратом для деградации при помощи процесса
3.4.4. мРНК i7 и СШ2, содержащие нонсенсмутации, накапливаются у мутантов и
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Нонсенсмутации в генах и
4.1.1. Локализация нонсенсмутаций .
4.1.2Жизнеспособность штаммов, несущих нонсенсмутации и .
4.2. Другие типы мутаций в гене , полученные в работе
4.2.1. Миссснсмутации
4.2.2. Повтор нуклеотидов.
4.2.3. Мутация неизвестной природы
4.3. Содержание белка у мутантов .
4.4. Влияние мутаций и 4 на процесс .
ВЫВОДЫ.ИЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Первая попытка объяснить роль 3 в терминации трансляции была сделана в году i , . Было предложено, что 3 имеет двойственную функцию 1 он может стимулировать связывание с рибосомой 2 может катализировать диссоциацию факторов от рибосомы после гидролиза пептидилтРНК, другими словами, выполнять в терминации трансляции функцию, подобную функциям факторов или в процессе элонгации белкового синтеза i , . ГТФ 3 стимулирует циклирование в процессе терминации, а в присутствии ГДФ ингибирует процесс i . Активация циклирования может быть достигнута двумя путями стимуляцией ассоциации факторов с рибосомой или стимуляцией отщепления от рибосомы после гидролиза псптидилтРНК. Таким образом, согласно первой гипотезе, функция 3 в терминации трансляции подобна функции фактора в процессе элонгации белкового синтеза 3 связывается с кодонспецифичными факторами терминации трансляции, увеличивая их сродство к терминационному комплексу, и тем самым стимулирует эффективность терминации трансляции , . В настоящее время широко распространена гипотеза, согласно которой 3 выполняет функцию, подобную функции в процессе элонгации трансляции. Показано, что 3 не увеличивает эффективность связывания 1 и 2 с рибосомой, когда пептидилтРНК находится в сайте, а стопкодон в сайте рибосомы i . В той же работе продемонстрировано, что увеличение циклирования в процессе терминации трансляции обеспечивается за счет стимуляции отщепления данных факторов от рибосомы. Было показано, что 3 не влияет на скорость гидролиза пептидилтРНК и освобождение белка. В данной работе была предложена модель, согласно которой 3 присоединяется к терминационному комплексу после гидролиза пептидилтРНК i . Поскольку было показано, что в клетке большая часть свободного 3 связана с ГДФ, предположили, что в рибосому проникает ГДФформа 3 viv . В данной работе была предложена следующая модель терминации трансляции у бактерий viv . На первом этапе 1 или 2 присоединяется к рибосоме, содержащей в сайте стопкодон. Затем происходит связывание 3 в комплексе с ГДФ с рибосомой и последующее быстрое отщеплением ГДФ. Диссоциация ГДФ приводит к установлению стабильного комплекса 3 с на рибосоме. Присоединение ГТФ к 3 приводит к изменению конформации 3, что в свою очередь ведет к формированию тесного комплекса между ГТФформой 3 и рибосомой, сопровождающегося отщеплением . На заключительном этапе происходит гидролиз ГТФ до ГДФ и отщепление ГДФформы 3, обладающей низким сродством к рибосоме viv . По окончании терминации трансляции рибосома способна к дальнейшему рециклированию, с использованием факторов от i i и i . Однако данная гипотеза о роли 3 в терминации трансляции нуждается в дальнейшем подтверждении. Факторы терминации трансляции первого класса
Еще в году было показано существование эукариотического фактора терминации трансляции i . Секвенирование из ретикулоцитов кролика v . ТВЗ1 . Для двух из этих белков, человеческого и из X. Хотя подобная активность не была изучена для дрожжевого белка . СП и ТВЗ1, вовторых, СП из X. В эукариотических клетках играет роль двух прокариотических факторов 1 и 2, т. Как и в случае , содействует гидролизу пептидилтРНК в отсутствии ГТФ. Это свидетельствует о том, что две важнейшие функции в терминации трансляции, т. РНК выполняются одним белком цит. Хотя точный механизм данного процесса до сих пор остается неизвестным. При сравнении аминокислотных последовательностей кодонспецифичных факторов терминации трансляции и , выделенных из разных организмов, были выявлены консервативные участки, гомологичные последовательностями Сконцевого домена фактора элонгации I . Ранее было показано, что Сконцевой домен содержит домены III, IV и V, трехмерная структура которых обладает сходством с акцепторным стеблем, антикодоновой петлей и Тпетлей тРНК, соответственно i . На основе этих наблюдений была предложена модель молекулярной мимикрии, согласно которой факторы терминации трансляции и подобны тРНК, с которыми они конкурируют в узнавании нонсенскодонов , I , . На сегодняшний день существуют две основные гипотезы, объясняющие механизм декодирования стопкодона iv , .