Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов насекомых

• Автор: Муха, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 253 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структурнофункциональная организация кластора рибосомных генов эукариот

1.1 РНКполимераза I

1.2 Организация рибосомных генов в геноме эукариот

1.3 Промотор I и структура нетранскрибируемого спейсера

1.4 Регуляция количества копий рибосомной ДНК

1.5 Инсерции в генах рибосомных РНК

2. Эволюционная изменчивость кластера рибосомных

генов эукариот

2.1 Согласованная концертная эволюция повторяющихся

структурных единиц кластера рибосомных генов эукариот
2.2 Эволюционная изменчивость генов рибосомных РНК
2.3 Эволюционная изменчивость транскрибируемых внешних и
внутренних спейсеров
2.4 Эволюционная изменчивость нетранскрибируемых спейсеров
3. Общая характеристика денсовирусов. Денсовирусы как векторы для генетической трансформации насекомых
и анализа регуляторных элементов генома
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Условия содержания В. i в инсектарии Поддержание культуры и наращивание биомассы ii Выделение и очистка тотальной ДНК
Инфузорий Б Тараканов
Растений
Г Других эукариот, исследованных в данной работе
Гельэлектрофорез и элюция фрагментов ДНК
Выделение нативных амплифицированных копий
рДНК ii
Получение и очистка фрагмента
Ферментативная обработка ДНК
Трансформация . i
Выделение плазмидной ДНК из . i
Очистка плазмидной ДНК
Введение метки в ДНК
Саузернблот анализ
Полимеразная цепная реакция
Методы работы с РНК
Методы работы с вирусом
Электронная микроскопия
Клонирование вирусной ДНК Секвенирование ДНК Методы статистической обработки Эксперименты на вьюнах i ii
Стимуляция созревания ооцитов и получение оплодотворенной икры Микроинъекции ДНК в зиготы вьюна Определение активности ргалактозидазы РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ i i генов рибосомных РНК эукариот
1.1 подобные гены рибосомных РНК
1.2 подобные гены рибосомных РНК
2. Создание универсальных праймеров и зондов, позволяющих методами ПЦР и блот гибридизации анализировать структуру РИБОСОМНОЙ ДНК ЭУКАРИОТ
2.1 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК ii.
2.2 Демонстрация применимости полученных универсальных праймеров и зондов для анализа структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов животных и растений.
Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов i и i i
Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного i iv,
ПДРФ рДНК насекомых отрлда тараканы
3. Клонирование, секвенирование и описание структуры
ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ПОВТОРА РДНК РЫЖЕГО ТАРАКАНА I
4. Внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера
РДНК I
4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК
4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК
4.3 Анализ генетической структуры лабораторных линий рыжего таракана
4.4 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана
5. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда
5.1 Построение филогенетического древа отряда
на основе нуклеотидных последовательностей генов рРНК
5.2 Анализ эволюционной изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов и i
Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых спейсеров
Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров
5.3 Анализ эволюционной изменчивости 5.8 генов у представителей отряда Тараканы
6. Денсовирус рыжего таракана i обнаружение,
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ И ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА
6.1 Обнаружение и электронномикроскопическое исследование
вируса
6.2 Клонирование вирусной ДНК
6.3 Последовательность нуклеотидов генома вируса и
структура концевых инвертированных повторов
6.4 Структура генома
Характеристика открытых рамок считывания и
сравнительный анализ белковых последовательностей.
Промоторы
Сигналы полиаденилирования
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития ВЬЮНА II .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Показано, что энхансеры не являются необходимыми элементами для инициации транскрипции, однако значительно усиливают процесс транскрипции. Интересным является наблюдение, сделанное в экспериментах на дрожжах было показано, что энхансеры I и II у этих организмов являются взаимозаменимыми, то есть могут усиливают транскрипцию, обусловленную любой из этих РНКполимераз . РНК со спейсерного промотора. При исследовании многих эукариотических организмов было установлено, что спейсерный промотор усиливает транскрипцию с основного промотора i , ii i , ii . Повидимому, основная роль спейсерных промоторов заключается в притягивание молекул РНКполимеразы I и трансактивирующих белковых факторов, что приводит к увеличению локальной концентрации этих молекул в непосредственной близости от основного промотора и тем самым приводит к усилению транскрипции рРНК. И наконец, последним из известных к настоящему времени структурнофункциональным элементом нетранскрибируемого спейсера эукариот является терминатор транскрипции ii i ТТ . У ряда организмов, например, у мышей данная последовательность терминирует транскрипцию, однако у других организмов, например X, ТТ выступает только в роли формирователя 3 конца прерРНК, а РНКполимераза продолжает транскрипционную активность, транскрибируя протяженную часть , расположенную за ТТ, однако сформированный хвост является нестабильным и быстро деградирует , . ДНК 1 амплификация, 2 магнификация и 3 дозовая компенсация. РНК передается следующему поколению. Отметим, что молекулярные процессы, лежащие в основе всех трех механизмов, обуславливающих изменение числа повторов рДНК, во многом остаются невыясненными возможно, амплификация единичной копии повтора рДНК является необходимым этапом как при магнификации, так и при дозовой компенсации другими словами, разбиение всех описанных механизмов на три названные группы во многом является условным. Амплификация это процесс образования большого числа экстрахромосомных копий гена либо совокупности генов и спей серных последовательностей их разделяющих при сохранении в геноме одной либо множества копий данных последовательностей. Амплификация описана для многих последовательностей ДНК у многих видов эукариот. Наиболее детально амплификация генов рРНК описана у простейших , и амфибий , , i, Нейфах и Тимофеева, Нейфах и Тимофеева, Кафиани и Костомарова, . Известно, что микронуклеус генеративное ядро инфузории содержит единичную копию рДНК, в то время как вегетативное ядро макронуклеус около 4 автономно реплицируемых копий генов рибосомных РНК , . Схема строения этих молекул изображена на рисунке 7. ДНК. На межоидовых гибридах X. X. i показано, что вне зависимости от направления скрещивания всегда амплифицируется рДНК X. ДНК. Было предложено несколько механизмов образования внехромосомных молекул рДНК Башкиров, 1 происходит внутрихроматидный кроссинговер, приводящий к вырезанию некоторого количества копий рДНК, реплицирующихся затем автономно вне хромосомы 2 внехромосомная экстракопия может образоваться в результате дополнительной локальной репликации участка хромосомы, содержащего рДНК, который затем реплицируется самостоятельно 3 автономнореплицируемые копии рДНК образовываются за счет активности обратных транскриптаз, то есть за счет обратной транскрипции прерРНК. Вероятно, у разных групп организмов на разных стадиях развития могут быть реализованы различные из перечисленных механизмов. Замедление скорости синтеза рРНК, которое во многом обусловлено количеством повторов рДНК, не может не сказаться на жизнеспособности организма. В клетках эукариот существуют механизмы, которые поддерживают количество повторяющихся генов на определенном уровне и вызывают востаноаление их нормального числа, если в определенный момент произошла делеция. Подобную регуляцию числа копий рДНК впервые описал Ритосса в экспериментах на плодовой мушке и это явление было названо магнификацией. При магнификзции происходит наследуемое увеличение числа копий генов рРНК в клетках полового пути в пределах одной линейной молекулы хромосомной ДНК.