Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)

• Автор: Пермякова, Наталья Владиславовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 АоЬаЫегтт ШтеаЫет как вектор для переноса экзогенной ДНК в растительный геном

1.2 Интеграция векторных последовательностей в геном трансгенных растений

1.3 Механизмы образования векторных последовательностей процессинг и перенос ТДНК в геном растений

1.4 Предпочтительные места встраивания ТДНК.

1.5 Частота встраивания плазмидных последовательностей в геном трансгенпых растений факторы, влияющие на частоту образования векторных фрагментов
1.6 Создание специальных конструкций, позволяющих избежать встраивания векторных последовательностей.
1.7 Нежелательные последствия встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1 Исходный материал
2.2 Выделение геномной ДНК из листьев табака и моркови.
2.3 Саузсрн блотгибридизация геномной ДНК трансгенных растений
2.4 Полимеразная цепная реакция, проводимая для подтверждения
трансгенного статуса растений и наличия у них векторной ДНК.
2.5 Схема секвенирования участков растительной ДНК, принадлежащих к
краевым повторам ТДНК
2.6 Электрофоретический анализ ДНК.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Анализ частоты встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
3.2 Особенности встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
3.3 Анализ наследования векторных фрагментов.
3.4 Влияние различных факторов на частоту вс траивания векторных
фрагментов в геном трансгенных растений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Такие инсерции трансгенов не только изменяют функционирование генов в районе встройки, но и одновременно являются маркерами тех генов, функционирование которых было нарушено встройкой. К настоящему времени описано большое число мутаций, индуцированных инсерциями трансгенов i, , , i i, , i i, , ii i, . Для доставки чужеродных генов в ядерный геном растений в настоящее время используются два подхода векторный перенос с помощью большой мегаплазмиды iплазмиды почвенной бактерии i i преимущественно для двудольных растений и прямой перенос с помощью генной пушки для однодольных. Тобласти большой мегаплазмиды . Последовательности вектора, окаймляющие ТДНК, представляют собой несовершенные повторы размером п. Именно по районам повторов происходит вырезание генов, заключенных в Тобласти мегаплазмиды, которые в дальнейшем и переносятся в ядро растительной клетки. Долгое время общепринятым оставалось представление, что в ядро растительной клетки переносится только фрагмент ДНК ТДНК, заключенный между правым и левым краевыми повторами i , i . Однако, на основании полученных за последние годы данных, стало очевидно, что фрагменты внешней векторной ДНК также могут быть перенесены и стабильно интегрированы в растительный геном , Vi , v . . . Очевидно, что причины такого переноса могут быть связаны с ошибками процессинга ТДНК в агробактериальной клетке i , . i . Установлено, что на всех стадиях процессинга ТДНК могут происходить ошибки, приводящие к вырезанию вместе с ТДНК и участков фрагментов векторной ДНК , Vi , v . . . Описаны случаи неправильного вырезания ТДНК фрагмента из плазмиды при недостатке белка Vi2 . ДНК области i, , . Установлено, что последовательности внутренних участков ТДНК, прилежащие к концевым повторам, также играют важную роль в процессинге. Так, например, удаление районов ТДНК, прилежащих к левой или правой границам Тобласти и замена их на фрагменты ДНК со случайными последовательностями нуклеотидов приводит к существенному возрастанию числа ошибок узнавания границ ТДНК . Фрагменты, образующиеся в результате ошибок процессинга ТДНК, различаются по протяженности и включают как всю векторную последовательность, так и отдельные ее участки v . i, , , i , . В растительный геном такие фрагменты встраиваются совместно с ТДНК или независимо от нее , Vi , . v Итак, при агробактериальной трансформации в ядерный геном растений одновременно с трансгенами могут быть перенесены и фрагменты векторной ДНК. Перенос векторных последовательностей, повидимому, является частью механизма переноса ТДНК, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений. Актуальность проблемы. Технология создания трансгенных растений основана на переносе генов из различных гетерологичных систем вирусов, микроорганизмов, животных, человека, поэтому трансгенные растения можно рассматривать как яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, изолирующих геномы различных организмов ii, , . Недостатком метода агробактериальной трансформации, широко применяемой для получения трансгенных растений, являются случайные ошибки при процессинге ТДНК, в результате которых в растительный геном могут быть интегрированы фрагменты векторных ДНК , Vi, , v . . . К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о встраивании векторной ДНК, не только в геном двудольных трансгенных растений. При агробактериальной трансформации фрагменты внешней векторной ДНК обнаруживались и в геноме однодольных растений, а также в геномах фибов и дрожжей i . . i . ii . .