Молекулярно-генетическая организация междисков политенных хромосом дрозофилы на уровне ДНК и междиск-ассоциированных белков

• Автор: Горчаков, Андрей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 164 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация политенных хромосом общие сведения.

1.2. Морфологическая организация межднеков.

1.3. Молекулярная организация междисков.

1.3.1. Содержание и конформационные особенности мсждисковой ДНК

1.3.2. Транскрипционная активность междисков

1.3.3. Анализ носледовательносгей нуклеотидов ДНК междисков.

1.3.4. Ассоциированные с мсждисками белки.

1.4. Метод Дтрансформации

1.4.1. Явление гибридного дисгенсза.

1.4.2. Строение Дэлсмента
1.4.3. Трансиозаза Дэлемента.
1.4.4. Механизм и реуляцня транспозиции. оддержапие Дцигопша.
1.4.5. Выбор нового сайга.
1.4.6. Дэлемснтопосредованный грансгснез . i
1.4.7. Получение переероек в районе инсерции гранспозонов с
использованием Дэлемент опосредованной рекомбинации у самцов.
1.4.8. Направленный мутагенез у дрозофилы.
1.4.9. Трансформация как подход к клонированию ДНК междисков
Заключение по обзору литературы
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Линин дрозофилы и их ведение.
2.2. Штаммы . i, основные этапы клонирования, полученные клоны ДНК. векторы
2.3. одготовка компетентных клеток . i.
2.4. Трансформация нлазмидной ДI в клетки . i.
2.5. Выделение нуклеиновых кислот.
2.5.1. Выделение геномной Д I дрозофилы.
2.5.2. Выделение плазмидной и космидной ДНК.
2.5.3. Быстрое выделение микроколичеств плазмшшой ДНК для
9 скрининга большой количества трансформантов.
2.5.4. Выделение фаговой ДНК
2.5.5. Выделение тотальной РНК из личинок дрозофилы.
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях
2.7. Элюпия ДНК из агарозного геля
2.8. Спасение мишени.
2.9. Приготовление препаратов политенных хромосом для световой микроскопии и гибридизации i i.
2 Иммуноокрашивание политенных хромосом.
2 Мечение ДНК.
2 Методы гибридизации нуклеиновых кислот
. Саузернблот гибридизация.
. Нозернблот гибридизация
. Флуоресцентная ДНКДИК гибридизация i i на политенных хромосомах I.
2 Полимеразная ценная реакция и олигонуклеотиды.
2 Скрининг геномной библиотеки
2 Трансформация генома дрозофилы
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДИК
2 Методы работы с белками.
Экспрессия рекомбинантных белков в Е. i.
Аффинная очистка белков с 6xi и эпитопами из лизатов
Е. i в нативных условиях
Разделение белков в трисглициновом полиакриламидном
геле
Перенос белков и вестсрнблот гибридизация.
2 Иммунизация кроликов
2 Детекция ргалактозидазы в органах и тканях дрозофилы.
2 Иммунофлюоресцентная детекция антигенов дрозофилы в органах,
тканях и целых эмбрионах.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Клонирование и секвенирование ДНК межлисков Е8Е и ЗА4А6
3.2. Анализ последовательности нуклеотидов ДНК междисков Е8Е и ЗА4А6. Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов междисковых ДНК
3.3. Транскрипционная активность в районе междиска Е8Е
3.4. Сингез и проверка активности i viv нового донорного транспозона дрозофилы I V. Возможные применения
3.5. Ген i. Описание и клонирование
3.6. рМН новый вектор для экспрессии белков в системе . i.
олучение антител.
3.7. Исследование хромосомной локализации продукта i в системе эктопической экспрессии I.4 в слюнной железе.
3.8. Доминантные фенотипы, возникающие при эктопической экспрессии i
3.9. Локализация нативного комплекса 4I на лолитенных хромосомах и в диплоидных клетках
3 Изучение иромоторной области и паттерна экспрессии гена i
3 Синтез аллелей гена i методом неточной эксцизии транспозона. Генетический анализ.
3i слабый доминантный модификатор эффекта положения на мозаичного типа.
3 Поиск потенциальных функциональных доменов i посредством сравнительного эволюционного анализа. Клонирование и анализ последовательностей на i у . ii. . и . i.
3 Сравнительный анализ аминокислотной последовательности хромодомена белка I.
Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Введение
В настоящее время взаимосвязь структурной организации и генетической активности различных районов интерфазных хромосом несомненна. Однако многие детали этой взаимосвязи до сих нор не ясны. Изучение данной проблемы одна из приоритетных задач современной биологии, свидетельством чего является большое количество работ и разнообразие выдвигаемых гипотез, посвященных этой теме.
Одной из наиболее удобных моделей для исследования интерфазных хромосом эукариот являются политенные хромосомы . . Эти хромосомы содержат до хромат ид. лежащих вплотную друг к другу, каждая из которых соответствует интерфазной хромосоме обзор i . Гомологичные хромосомы конъюгируют, поэтому политенные хромосомы представлены в ядре гаплоидным числом. Упорядоченное расположение материала хромосом ведег к образованию поперечной исчерченности. представляющей собой чередование компактных темных в световом микроскопе хромомеров, или дисков, и менее плотных, и потому светлых, межхромомеров, или междисков. Именно эти особенности организации политенных хромосом определяют преимущество данной модели перед другими специфический рисунок дисков и большая степень политении позволяют проводить точную привязку исследуемых последовательностей ДНК к определенным районам, с высоким разрешением картировав сайты связывания многих белковых факторов и проводить тонкий структурнофункциональный анализ хроматина.
Актуальность


В году Стеффенсен провел анализ радиоавтографов полигонных хромосом личинок дрозофилы, которых выращивали на среде е 3Н тим идином. Исходя из преимущественного распределения зерен серебра над дисками, он пришел к выводу, что ДНК находится именно в дисках, а междиеки предс авл я ют собой белковые образования, соединяющие диски в единую структуру , . С друюй стороны, к тому времени уже были получены первые доказательства присутсвия ДНК в междисках окрашивание но Фелыену ii. Жимулев. УФпогдощение материалом междисков , . Жимулев. Позже более точные данные но содержанию ДНК. РНК, гисгонов и других белков были получены Нолом и Магейко , . ДНК была обнаружена как в дисках, так и междисках, при з том распределение материала было около 1, соответственно. Концентрация РНК варьировала в некоторых дисках, но в общем соответствовала соотношению ядрышко диск междиск. С помощью меюдов окрашивания белков было показано, что окрашивание па аргинин было в основном присуще не тоновой фракции в дисках, в то время как окрашивание на группы было наиболее сильным в остаточном белке в междисках. ДНК различных видов рода i совпадали с длиной ДНК. ДНК таких хромосом Зайниев и др. ДНК толщиной нм, которые полноеью удалялись ДНКазой I, и не удалялись РНКазой i. Гак, количественная гибридизация серии клонов, перекрывающих район . ДНК, выделенной из диплоидной и поли генной тканей, демонстрировала осугсгвие недоренликации ДНК в междисках, что свидетельствовало о непрерывности хромонем в составе молитенной хромосомы i . Доля ДНК, входящей в состав междисков, относительно общего количества ДНК невелика и по разным источникам составляет 1,0 Саььрегяоп. Основываясь на своей модели полигонных хромосом, В. Веер манн провел сравнение количества ДНК в гаплоидном наборе . Данные Лэйрда о более чем оч содержании ДНК в междисках. ЭМ негативов целых политенных хромосом i, , по всей видимости, завышены Сорса. ДНК. Очевидно, подход, использованный Сорса, являегся более точным, поскольку позволяет учитывать вклад большого числа тонких дисков, которые не выявляются в подходе, предлагаемом Лэйрдом. Сорса пишет Средняя длина наиболее сильно растянутых междисков в i районе Ххромосомы менее 0. ДНК в фибриллах междисков очень низко, и достаточно только для образования нукдеосом. Самые мелкие хромомеры района такие как диск ЗА5. ДНК представлена не нм. Даже если нуклеосомы и суцествуюг в междисках, кажется, чю умеренное раздавливание после фиксации уксуснокислым метанолом раскручивает зги структуры, и дальнейшее расягивание полигонных хромосом незначительно увеличивает длину фибрилл междисков. Чтобы исключить возможность того, что ЗОнм нуклеосомнме фибриллы, которые, как предполагалось, существуют в междисках целых ноли генных хромосом, разрушаются перерастяжением, было проведено сравнение одних и гех же междисков в нерастянутом и растянутом сосюянии i, . Оказалось, чю нельзя увеличить длину междисков растягиванием более чем в 1. Кроме того, с растяжением толщина отдельных междисковых фибрилл 5 нм почти не меняется. В фибриллах, соединяющих диски, не обнаруживаюся более высокие уровни спиральной упаковки или даже нуклеосомной упаковки. Из этой цитаты можно сделать вывод об относительно растянутом сосюянии междисков. Однако существуют и другие данные относительно возможной нуклеосомной упаковки ДНК в составе междисков Барский. Ананьев. Миллера из лолтенных хромосом были получены содержащие нуклеосомы пп и длиной мкм. Учитывая коэффициент упаковки ДНК на нуклеосомном уровне, равный 6, и средний размер диска тлл. ДНК упакована нуклеосмно и в дисках, и в междисках. Недавно были получены молекулярные данные, свидетельствующие о нуклеосомной организации междисковой ДНК . При обработке хроматина м икрококковой нуклеазой происходит гидролиз несвязанной с нуклеосомами линкериой ДНК, в результате чего о присутствии нуклеосом можно судить по накоплению коровых фрагментов ДНК длиной 6 п. После электрофореза и Саузернблог гибридизации с серией уникальных зондов из районов междисков помимо мономерной формы наблюдается формирование так называемой лестницы из фрагментов, соответствующих и олигомерам нуклеосом.