Фенотипическое проявление гена SUP35 Pichia methanolica и прионизация его продукта в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Задорский, Сергей Павлович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 179 с. : ил

1. Герминация трансляции генетический и эпигенетический контроль и эволюционная консервативность обзор литературы.

1.1. Структура и функции факторов терминации трансляции

1.2. Генетическое изучение факторов терминации трансляции и 3 у дрожжейсахаромицетов.

1.3. Эпигенетический контроль терминации трансляции у vii. Система 4.

1.4. Эволюционная консервативность факторов терминации трансляции эукариот и процесса прионизации

1.5. Постановка задачи работы.

2. Материалы и методы.

2.1. Штаммы и плазмиды, используемые в работе.

2.1.1. Штаммы дрожжей vii

2.1.2. Штаммы ii i.

2.1.3. Плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Генетические методы
2.3.1. Учет фенотипов.
2.3.2. Стандартные генетические методы
2.3.3. Элиминация и АУподобных факторов
2.3.4. Определение Iстатуса штаммов
2.3.5. Количественное определение частоты индукции или АГподобных факторов.
2.4. Статистическая обработка результатов.
2.5. Методы генной инженерии
2.6. Методы микроскопироваиия.
3. Результаты
3.1. Получение центромерных и многокопийных плазмид, содержащих гены , , ,
3.2. Получение плазмид, использованных для замещения гена в
хромосоме .vii генами , , ,
3.3. Изучение жизнеспособности трансгенных штаммов с замещением гена генами , , или
3.4. Получение трансгенных штаммов . vii с замещением в хромосоме собственного гена генами , , и .
3.5. Нонсенссупрессия в трансгенных штаммах . vii с замещением
собственного гена генами , , или .
3.6. Определение 7Vстатуса трансгениых штаммов
3.7. Нонсонссуирессия у трансформантов нетрансгенных штаммов .vii центромерными или многокопийными плазмидами с , и созданными на их основе гибридными и делеционными конструкциями
3.8. Нонсенссупрессия в трансгенных штаммах . vii при введении генов , и созданных на их основе гибридных и делеционных конструкций на центромерных или i окопийных плазмидах.
3.8.1. Нонсенссупрессия у трансформантов трансгенных штаммов .vii с геном в хромосоме.
3.8.2. Нонсенссупрессия у трансформантов трансгенных штаммов .vii с геном в хромосоме
3.8.3. Нонсенссупрессия у трансформантов траисгенных штаммов .vii с геном в хромосоме
3.8.4. Нонсенссупрессия у трансформантов трансгенных штаммов .vii с геном в хромосоме.
3.9. Изучение гетерологичной прионизации 3 в системах, содержащих гены
3.9.1. Индукция при амплификации .i в нетрансгенных штаммах .vii
3.9.2. Изучение гетерологичной прионизации белка при помощи тетрадного анализа
3 Идентификация и изучение фактора I прионной формы белка ii i .
. Индукция фактора 7 в штаммах с в хромосоме в результате амплификации генов или ИЗ
. Генетический анализ наследования фактора Р5р
. Повторная индукция фактора Рр
. Изучение агрегации 3 в трансгениых штаммах с в хромосоме
. Индукция I количественная оценка и зависимость от фактора ЯЛЛ .
. Изучение механизмов индукции и I при амплификации
или в штаммах i .
3 Прионизация в штаммах, содержащих гены и .
. Индукция нестабильного Рподобного фактора в штаммах, содержащих гены и
. Генетический анализ взаимодействия аллели и фактора .
4. Обсуждение.
Список литературы.
Обозначения и сокращения.
В работе была использована стандартная трехбуквенная номенклатура для обозначения генотипов и фенотипов штаммов дрожжей , Захаров и др., .
Использованные и полученные в ходе работы варианты генов обозначались следующим образом
полноразмерный ген .vii
полноразмерный ген .i
ген .i с делецией 5области, кодирующей домены и М белка
V гибридный ген, состоящий из 5части и Зчасти . Кодируемый этим геном белок объединяет домен .i и Сдомен .vii
гибридный ген, состоящий из 5части и Зчасти . Кодируемый этим геном белок объединяет домен .vii и Сдомен .i.
Для обозначения полученных в работе трансгенных интегрантов .vii с замещением в хромосоме применялась следующая номенклатура перед названием исходного нетрансгенного штамма указывался номер полученного на его основе трансгенного интегранта и один из символов Р, , или , обозначающий, что ген в хромосоме этого штамма заменен на один из генов , , или , соответственно. Например, название 1Д4 обозначает 1й по счету трансгенный интегрант с геном в хромосоме на месте , полученный на основе штамма Д4.
Применялись также следующие обозначения и сокращения
Среда С синтетическая среда со всеми добавками, необходимыми для роста данного штамма .vii
, С, и т.д. селективные среды без урацила, лейцина, аденина и т.д. от i обозначение фенотипа, наблюдаемого в присутствии трансляционных супрессоров
ГГХ хлорид гуанидина п.н. пар нуклеотидов т.п.н. тысяч пар нуклеотидов.
Применялось стандартное однобуквенное обозначение аминокислот А аланин,
Б глутаминовая кислота,
глутамин,
0 аспарагиновая кислота,
аспарагин,
Ь лейцин, в глицин,
К лизин,
8 ссрин,
V вапин,
И аргинин,
Т треонин,
Р пролин,
1 изолейцин,
М метионин,
Б фенилаланин,
У тирозин,
С цистеин,
триптофан,
Н гистидин.
Введение


При этом выделенные в 3 домена соответствуют доменам тРНК домен соответствует домену тРНК, содержащему антикодоновую петлю, и осуществляет, повидимому, узнавание нонсенскодонов . Мдомен подобен акцепторному стеблю тРНК, взаимодействующему с аминоациладенилатами, и катализирует пептидилтрансферазную реакцию v . Сдомен, повидимому, соответствует Тстеблю и осуществляет взаимодействие с фактором 3 I . РРАс Лечвард и др. Каждый из доменов , М и С белка содержит абсолютно косервативные участки, входящие, повидимому, в активные центры этого белка. Консервативный мотив I, находящийся в домене, предположительно шрает существенную роль во взаимодействии с мРНК, заключающемся в узнавании кодоновтерминаторов иили осуществлении фиксации в нужной ориентации на рибосоме. Мотив необходим для осуществления псптидилгрансфсразной реакции см. Киселев и др. Мотив ixx расположен в консервативном участке Сдомена и необходим для взаимодействия с 3 iii . Для эффективного завершения процесса трансляции, кроме факторов терминации трансляции первого класса, необходимы также факторы терминации второго класса 3 у прокариот и 3 у эукариот. Функции этих факторов значительно различаются у прокариот и эукариот. Это следует уже из того факта, что у прокариот отсутствие 3 не летально для клетки, хотя и может приводить к увеличению времени генерации ii . ТерАванесян, Дагкесаманская, i, . Прокариотический фактор 3 структурно гомологичен фактору элонгации трансляции . ГТФазной активностью, для стимуляции которой необходимо взаимодействие этого фактора с рибосомой, но не с факторами 1 или 2 . Связывание 3 с рибосомой, по всей видимости, также не зависит от факторов 1 и 2. I . Основной функцией 3 является, по всей видимости, осуществление диссоциации с рибосомы vv . Отсутствие или нехватка 3 могут частично или полностью компенсироваться другими факторами фактором элонгации и фактором посттерминации i i ii . Эукариотический фактор 3 не имеет протяженной гомологии с фактором 3 прокариот. В отличие от 3, фактор 3 имеет значительную гомологию Сконцевой части около от всей последовательности с факторами элонгации трансляции 1 iv . Этот участок белка консервативен в пределах эукариот см. ИнгеВечтомов и др. IVv, и является жизненно необходимым v . Сконцевая часть 3 содержит консервативные мотивы участки 1 4, отвечающие за связывание и гидролиз iv . АМФзависимого фосфорилирования ii , , значение которого не выяснено 2 относительно коротких участка, обеспечивающих связывание с фактором v . Отметим, что у . Повидимому, концевая часть 3 может быть в свою очередь разделена на 2 структурнофункциональных домена, обозначенных нами здесь как С1 и С2 см. Домен С1 содержит каталитический центр связывающие мотивы и, повидимому, участок связывания с рибосомой. Домен С2 отвечает за взаимодействие с белком . Предположение о том, что домены С1 и С2 обособлены не только функционально, но и пространственно, нуждается в проверке, что удастся сделать, если будет выполнен рентгеноструктурный анализ белка 3 по Киселев, Фролова, . Функциональное значение этой части белка и особенности ее структуры будут обсуждены далее см. Как и 3, фактор 3 является ГТФазой, но для стимуляции его ГТФазной активности необходимо взаимодействие 3 как с рибосомой, так и с фактором . Однако, по крайней мере, в системе i vi, гидролиз пептидилтРНК под действием и гидролиз ГТФ под действием комплекса 3 могут быть полностью разобщены v . РНК может выполняться без участия 3 по крайней мере, без его 1ТФазной активности, хотя i vi 3 значительно стимулирует осуществление этой реакции при низкой концентрации столкодонов vv . Рисунок 1. Общая схема структурнофункциональной организации факторов терминации трансляции второго класса семейства еКИЗ. М и С структурнофункциональные домены белка еНРЗ. В участки, ответственные за взаимодействие с . РРЗ человека, по МегЫоуа е1 а1. РИ1 прионизующий для З . Конкретная функция фактора еРИЗ в терминации трансляции до сих пор точно не определена, на этот счет сосуществуют различные гипотезы.