Получение и использование микродиссекционных ДНК-библиотек при анализе хромосомных патологий человека

• Автор: Карамышева, Татьяна Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хромосомные патологии человека

1.1.1. Врожденные хромосомные аномалии.

1.1.2. Реорганизация хромосом при онкологических заболеваниях

1.2. Методы цитогенетического анализа

1.2.1. Развитие цитогенетических методов исследования

1.2.2. Методы цитологического анализа хромосом.

1.2.3. I i гибридизация в современной цитогенетике.

1.2.3.1. ДНКзонды, используемые в i i гибридизации
1.2.3.1.1. Клонированные последовательности
1.2.3.1.2. ДКбиблиотеки индивидуальных хромосом и хромосомных районовЗО
1.2.3.1.3. Системы универсальной амплификации ДНК
1.2.3.1.4. Микродиссекция, как метод получения хромосомо и
районспецифических ДНКбиблиотек
1.2.3.1.5. Способы мечения и детекции ДНКзондов.
1.2.3.2. Детекция хромосомных перестроек с помощью i i гибридизации.
1.2.3.3. Многоцветная i i гибридизация.
1.2.3.3.1. I
1.2.3.3.1.1. цветная I.
1.2.3.3.1.2. XI
1.2.3.3.1.3. Многоцветный бэидинг хромосом i i МСВ.
1.2.3.3.1.4. Спектральное кариотипирование i
1.2.3.4. Сравнительная геномная гибридизация iv i
iii
1.3. Анализ хромосомных аберраций
1.3.1. Пренатальная хромосомная диагностика. ,.
1.3.2. Анализ врожденных хромосомных патологий.
1.3.3.1. Анализ хромосомных перестроек при онкологических заболеваниях.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Суспензии ФГА стимулированных лейкоцитов периферической крови
человека
2.1.1. Культивирование лейкоцитов периферической крови.
2.1.2. Фиксация митотических клеток
2.1.3. риготовление препаратов метафазных хромосом для I
2.1.4. Приготовление препаратов мегафазных хромосом для микродиссекции
2.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом человека из пункции
костного мозга
2.3. дифференциалыюе окрашивание мегафазных хромосом.
2.4. Подготовка микропипеток и игл для микродиссекции
2.4.1. Микродиссекция метафазных хромосом
2.5. ПЦР е частично вырожденным праймером
2.5.1. с i, ДНК полимеразой
2.5.2. с Т7 Vi 2.0 ДНК полимеразой
2.6. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДКбиблиотек
2.7. Получение С2 ДНК из плаценты человека
2.8. Супрессионная i i гибридизация
2.9. Детекция на цитологических препаратах меченого ДНКзонда
2.9.1. Детекция на цитологических препаратах биотин дУТФ меченого
ДНКзонда.
2.9.2. Выявление фрагментов ДНК. меченых дигоксигениндУТФ
2.9.3. Совместное выявление двух гаптеимеченых ДНКпроб на одном
препарате.
2 Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка новой версии метода получения хромосомо и
райоиспецифичных ДНКбиблиотек микродиссскцией метафазных хромосом и последующей универсальной амплификацией ДНК
3.1.1. Оптимизация условий универсальной амплификации ДНК
3.1.1.1. Выбор системы универсальной амплификации и праймеров
3.1.1.2. Выбор ДНК полимеразы для универсальной амплификации ДНК
3.1.1.3. Влияние концентрации ионов 2 на эффективность
3.1.1.4. Влияние концентрациипраЙмера на эффективность .
3.1.1.5. Влияние других компонентов на эффективность амплификации
3.1.2. Оптимизация условий универсальной амплификации диссекционного
материала
3.1.3. Анализ факторов, влияющих на эффективность амплификации
диссектированного материала
3.1.4. Оценка эффективности микродиссекции хромосом и последующей для получения хромосомосиецифичных ДНКбиблиотек
3.2. Получение хромосомоспецифичных ДНКбиблиотек человека
3.2.1. Получение районспецифичных ДНКбиблиотек для многоцветного
бэндинга хромосом МСВ
3.3. Анализ врожднных хромосомных патологий
3.3.1. Анализ хромосомных транслокаций
3.3.1.1. Несбалансированные транслокации хромосом.
3.3.1.2. Сбалансированные транслокации хромосом.
3.3.2. Анализ малых сверхчисленных хромосом методом получения
хромосомоспецифичных ДНКбиблиотек аномальных хромосом и обратной i i гибридизацией.
3.3.3. Анализ делений хромосомных районов.
3.3.4. Использование хромосомоспецифичных ДНКбиблиотек для проверки
результатов рутинного хромосомного анализа.
3.4. Анализ хромосомных аномалий в малигнизированных клетках
3.4.1. Сравнительный анализ метода микродиссекции метафазных хромосом,
МСВ и .
3.4.2. Использование хромосомосиецифичных ДНКбиблиотек, полученных с
помощью новой версии метода микродиссекции метафазных хромосом, для детекции ожидаемых транслокаций хромосом
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.ПО
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Разработан новый протокол получения ДНКбиблиотек микродиссекцией мстафазных хромосом, характеризующийся высокой эффективностью и воспроизводимостью результатов, позволяющий получать качественные ДНКзоиды из одной копии диссектированного материала. Практическая значимость предложенного метода была продемонстрирована на примере анализа хромосомных аномалий как врожденных, так и возникших при злокачественной трансформации клеток. Проведенные исследования позволили во всех случаях с высоким уровнем разрешения идентифицировать материал маркерных хромосом. Для детального анализа одной из маркерных хромосом впервые в мире был получен набор последовательных ДНКбиблиотек путем микродиссекции одной копии маркерной хромосомы. В работе получены комплект хромосомоспецифичных ДНКбиблиотек. ДПКбиблиотск для получения многоцветного бэндинга хромосом 3 и человека. Практика использования разработанного метода показала его высокую эффективность, что позволяет рекомендовать его для широкого использования в медикогенетической диагностике, а также ставит вопрос об изменении существующей стратегии анализа сложных хромосомных патологий, принятой в настоящее время медикогенетической службой Российской Федерации. Апробация работы. Ежегодный Конгресс Немецкого общества генетики человека, проводимый совместно с Австрийским обществом генетики человека и Швейцарским обществом медицинской генетики , i, i i ii i ii iii i , , , . Всемирный Конгресс по клеточной и молекулярной биологии i 8 , , . Конференция, посвященная летию Новосибирского Областного диагностического центра Новосибирск, ноябрь, года. Семинар общества медицинских генетиков г. Новосибирска сентябрь, . Основные материалы опубликованы в 4х печатных работах в отечественных и зарубежных журналах. Вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, посвящнных разработке новой версии метода получения специфических ДНКбиблиотек, получению хромосомо и районспецифических ДНКбиблиотек человека, анализу врожднных хромосомных аномалий и хромосомных перестроек в малигнизированных клетках. Структура и объм диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 9 ссылок. Диссертация изложена на 0 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и содержит 1 таблицу. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Хромосомные патологии играют существенную роль в этиологии наследственных и врожднных заболеваний человека и вносят большой вклад в прс и постнатальную смертность. Установлено, что более спонтанных абортов и около 7 мертворождений обусловлены хромосомным дисбалансом, а частота хромосомных нарушений у детей с множественными врожднными пороками развития достигает Пузырв, . Нарушение мейоза при формировании гамет или митоза на ранних стадиях эмбрионального развития может приводить к численным хромосомным аномалиям, большая часть которых является причиной гибели плода на различных стадиях развития. Большинство случаев анеуплоидии, которые совместимы с жизнью, приводят к множественным врожднным порокам. Для человека существует лишь небольшой список трисомий и моиосомий, совместимых с рождением жизнеспособного потомства. Наименее серьезные нарушения развития вызывает ансуплоидия половых хромосом. Доклад научной группы ВОЗ, . Более разнообразный характер нарушений развития связан со структурными хромосомными перестройками, приводящими к нарушениям представленности в клетке небольших хромосомных районов. Типичными примерами таких хромосомных аномалий могут служить несбалансированные транслокации хромосом и небольшие сверхчисленные хромосомы i, . Реорганизация хромосом также тесно связана с трансформацией клеток, их малигнизацией и дальнейшей опухолевой прогрессией. В настоящее время известны многочисленные примеры хромосомных перестроек, которые либо обуславливают предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, либо могут являться прямой причиной клеточной малигнизации i . Опухолевая прогрессия также обычно связана с появлением новых клеточных клонов, несущих хромосомные перестройки .