Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Аксенова, Анна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 153 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ТОЧНОСТИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ

1.1. Характеристика процесса трансляции и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции

1.2. Генетический контроль точности трансляции. Факторы, влияющие на считывание стоп кодонов.
1.2.1. Роль мутантных и естественных нонсенссупрессорных тРНК в считывании стопкодонов.

1.2.2. Роль факторов терминации в распознавании стопкодонов.

1.2.3. Роль рРНК и рибосомных белков в поддержании точности трансляции.

1.2.4. Роль факторов элонгации трансляции в поддержании точности трансляции

1.2.5. Роль компонентов системы деградациисодержащих нонсенсмутации мРНКв поддержании точности трансляции.

1.2.6. Роль белка РаЫ в поддержании точности трансляции.

1.2.7. Влияние тоннельного белка рибосомы Лр9 и связанных с рибосомой шаперонов на точность трансляции.
1.2.8. Роль белков цитоскелета в регуляции точности трансляции. Новые функции факторов терминации трансляции.
1.2.9. Другие факторы, влияющие на считывание стопкодонов.
1.3. Эпигенетический контроль точности трансляции.
1.3.1. Фактор Р и его влияние на точность трансляции.
Молекулярногенетический и биохимический анализ свойств агрегатов белка Бир.
1.3.2. Белокбелковые взаимодействия Бир влияние на
поддержание и свойства фактора Р.
1.3.3. Взаимодействие фактора геД с другими прионами.
1.3.4. Эпигенетический детерминант 5Р вовлеченный в
контроль точности трансляции
1.4. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы
2.2. Плазмиды и библиотеки генов.
2.3. Среды и условия культивирования.
2.4. Генетические методы.
2.5. Молекулярногенетические и биохимические методы.
2.6. Математические и статистические методы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Идентификация генов, влияющих на фенотипическое
проявление и поддержание детерминанта Р
3.1.1. Использование центромерной библиотеки для выявления
генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта .
3.1.2. Анализ вставок геномной ДНК, изолированных в составе
плазмид УСр4, УСр, УСр, УСр6, УСр7 и УСр4.
3.1.3. Анализ вставок геномной ДНК, изолированных в составе
плазмид УСр5, УСр5, УСр1.
3.2. Идентификация криптических мутаций в гене 5ТР,
влияющих на фенотипическое проявление
3.2.1. Аллель дикого типа гена БиР, вносимая на
центромерной плазмиде, приводит к маскировке фенотипического проявления
3.2.2. Хромосомная аллель гена из штамма 4ВП содержит мутацию
3.2.3. Штамм 7,, несущий мутацию , также содержит мутацию в гене .
3.2.4. Мутации 0 и не имеют самостоятельного супрессорного эффекта
3.3. 3 зависимая регуляция точности трансляции и ее влияние на проявление и свойства детерминанта I
3.3.1. Сверхэкспрессия гена 3 вызывает аллосупрессию в штаммах 7Р
3.3.2. Сверхэкспрессия гена 1 оказывает антисупрессорный эффект в штаммах i, опосредованный каталитической функцией фосфатазы .
3.3.3. Делеция гена 3 обладает анти супрессорным эффектом по отношению к мутации в i штаммах
3.3.4. Делеция гена 1 в 7 штаммах приводит к слабому нонсенссупрессорному эффекту. Поиск альтернативных мишеней белка На
3.3.5. Аллосупрессорный эффект сверхпродукции белка На опосредован его взаимодействием с и ингибированием каталитической активности этой фосфатазы.
3.3.6. Сверхэкспрессия фактора элонгации трансляции I, являющегося мишенью фосфатаз , имеет антисупрессорный эффект в штаммах i.
3.3.7. 4 и игр штаммы содержат разное количество белка На
3.4. Элиминация I под действием является На зависимой.
3.4.1. Эффективность излечивания хлоридом гуанидина детерминанта 5Р значительно ниже, чем фактора
3.4.2. I и i штаммы различаются по чувствительности к
3.4.3. обладает излечивающим эффектом в отношении детерминанта I
3.4.4. Делеция гена 3 приводит к чувствительности штаммов к хлориду гуанидина и блокирует способность детерминанта
3.4.5. Мутации 3, влияющие на способность На
взаимодействовать с фосфатазой Ррг1 и ингибировать ее активность, приводят к чувствительности роста несущих их штаммов к действию СиНС1 и обуславливают их конститутивный антисупрессорный фенотип, несмотря на
действие .
3.4.6. Штаммы ю более устойчивы, по сравнению со
штаммами , к аминогликозидным антибиотикам и
хлориду лития.
3.5. Делеция гена 3 снижает эффективность излечивания
хлоридом гуанидина фактора I.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Эффективность считывания стопкодонов как значащих может быть оценена количественно с помощью специальных репортерных систем или качественно, на фенотипическом уровне, при изучении супрессии нонсенсмутаций в генах, контролирующих биосинтез аминокислот или азотистых оснований. На возможность и эффективность считывания стопкодонов как значащих влияет множество факторов различной природы, которые подробно рассмотрены ниже. Генетический контроль точности трансляции. Факторы, влияющие на считывание стоп кодонов. Роль мутантных и естественных нонсенссупрессорных тРНК в считывании сгопкодонов. Нонсенссупрессия может быть обусловлена различными событиями как мутационной, так и немутационной природы. Среди классических мутаций, вызывающих прочтение стопкодонов, прежде всего следует упомянуть мутации, изменяющие структуру антикодона тРНК. Такие нонсенссупрессоры обычно доминантны и демонстрируют строгую кодоновую специфичность. У эукариот они подробно изучены у дрожжей . РНК , а. Нонсенссупрессорные мутации, приводящие к изменению антикодонового стебля тРНК и нуклеотидного окружения вокруг антикодона, описаны, в основном, у прокариот ТерАванесян и ИнгеВечтомов, . Наряду с мутантными тРНК, осмысление стопкодонов может быть осуществлено и за счет естественных, латентных супрессорных тРНК, антикодоны которых взаимодействуют со стопкодонами в нарушение канонических правил спаривания нуклеотидов. РНК, они являются важным инструментом неточности, изобретенным природой. Именно существование естественных нонсенссупрессорных тРНК и обуславливает возможность прочитывания стопкодонов как значащих во всех случаях, не связанных с мутационными изменениями в тРНК. Первая латентная нонсенссупрессорная тРНК была выявлена у . Ею оказалась триптофановая тРНКТгр с антикодоном ССА, которая была способна взаимодействовать с кодоном , что приводило к синтезу удлиненного белка оболочки фага, необходимого для формирования инфекционных частиц i, . Спустя десятилетие естественные нонсенссупрессорные тРНК были выявлены и у эукариот. Замечательным примером, демонстрирующим потенциально адаптивный механизм этого явления, является тирозиновая тРНКТуг с антикодоном , экспрессируемая в листьях табака и пшеницы, и также найденная в дрожжах. Эта тРНК обеспечивает считывание кодона как значащего, однако, превращение гуанина в антикодоне этой тРНК на кьюозин, которое может осуществляться в результате реакции трансгликозилирования, практически полностью блокирует способность этой тРНК взаимодействовать с кодоном . Во втором положении антикодона этой тРНК находится псевдоуридин, что характерно для всех эукариотических цитоплазматических тирозиновых тРНКТуг. Интересно, что замещение псевдоуридина на уридин в этой тРНК также блокирует ее нонсенссупрессорные свойства, свидетельствуя о том, что такая модификация антикодона является существенной для неканонических взаимодействий . САА и . Сверхэкспрессия в дрожжах изоакцепторной тРНКС1п с антикодоном приводит к супрессии значительной доли мутаций см. В качестве латентных амберсупрессоров распознавание кодона могут выступать и изоакцепторные лейциновые с антикодонами САА и . Распознавание стопкодона в этом случае происходит за счет неканонических взаимодействий АА и во втором и в третьем положении соответственно см. Кроме того, распознавание стопкодона у эукариот могут обеспечивать цистеиновая с антикодоном и аргининовая с антикодоном см. Таким образом, в клетках эукариот содержится значительное число естественных тРНК, способных взаимодействовать со стопкодонами и обепечивать их прочитывание. Интересно, что во многих случаях способность этих тРНК взаимодействовать со стопкодонами регулируется за счет появления в них определенных модификаций. Роль факторов терминации в распознавании стопкодонов. За взаимодействие со стопкодонами с аатРНК конкурируют белковые факторы терминации трансляции, которые катализируют гидролиз связи между поли пептидной цепью и пептидилтРНК и обеспечивают завершающий этап в синтезе белка терминацию трансляции. У эукариот терминация трансляции опосредована двумя жизненноважными факторами и 3 v . Точность трансляции на этом этапе зависит от того, насколько эффективно и аккуратно работают эти белки.