Молекулярно-генетический анализ плейотропных мутаций Agrobacterium radiobacter 5D-1, влияющих на существенные для ассоциации с растениями процессы

• Автор: Руслякова, Марина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. стр.

ЧАСТЬ I.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СИСТЕМЫ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ

У БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА ШЮВЫСЕАЕ.

1.1. Т рансформация.

1.2. Трансдукция.

1.2.1. Общая трансдукция.

1.2.2. Специализированная трансдукция.

1.3. Конъюгация.

1.4. Системы для введения транспозонов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штамм ы и плазм иды.
2.2. Культивирование бактерий.
2.3. Методы исследований.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание генетической карты хромосомы i
i, локализация генов азотного метаболизма.
3.1. Сравнительное исследование эффективности различных приемов локализации мутаций на генетической карте при
конъюгационных скрещиваниях у А.га1юЪасег.
3.2. Кольцевая карта хромосомы А.гаВюЬаег 5Б1.
3.3. Локализация генов, конролирующих азотный метаболизм.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЧАСТЬ II.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССОВ, СУЩЕСТВЕННЫХ ДЛЯ ЭФФЕКТИВ
НОСТИ АССОЦИАЦИЙ БАКТЕРИЙ С РАСТЕНИЯМИ
1.1. Генетический контроль синтеза и активности нитрогеназы.
1.1.1. i i.
1.1.2. ii.
1.1.3. Другие ассоциативные диазотрофы.
1.2. Синтез фитогормонов почвенными бактериями.
1.2.1. Псевдомонады.
1.2.2. Агробактерии.
1.2.2.1. i i .
1.2.2.2. i i.
1.2.2.3. i i.
1.2.3. Ризобии и брадиризобии.
1.2.4. Азоспириллы.
1.3. Репликация плазмиды СоШ 1 типа.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы и плазмиды.
2.2. Культивирование бактерий.
2.3. Растворы.
2.4. Методы исследований.
2.4.1. Определение количества ИУК.
2.4.2. Трансформация плазмидной и общей ДНК.
2.4.3. Выделение плазмидной ДНК.
2.4.4. Выделение общей ДНК.
2.4.5. Определение концентрации ДНК.
2.4.6. Ферментативная обработка ДНК.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Доказательство сцепления признаков изменения метаболизма азота и синтеза индолилуксусной кислоты у Ыгмутантов.
3.2. Исследование влияния гмутаций на репликацию плазмид СоШ 1 типа в клетках А. гснИоЬаМсг.
3.3. Клонирование и идентификация фрагмента хромосомной ДНК АоЬаегтт гаскоЬасег 1, участвующего в контроле азотного метаболизма, биосинтеза индолилуксусной кислоты и репликации
плазмид СоШ 1типа.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возникновение в скрещиваниях трансформантов, восстановивших способность фиксировать азот, свидетельствует о возможности нормальной экспресси пгенов ризобий в клетках азотобактера i . i . , . Интересно отметить, что такие рекомбинанты не образуются, если реципиент несет мутации в генах, регулирующих синтез нитрогеназы. На сегодняшний день при изучении генетического контроля и молекулярных механизмов взаимодействия почвенных бактерий с растениями и азотфиксации в ассоциации активно используется диазотрофная сапрофит нал вступающая в ассоциативные взаимоотношения с растениями агробактерия А. Ьаег 5И1 Чумаков и др. С помощью методов трансформации и электропорации в клетки агробактерии были введены контролирующие азотфиксацию и взаиодействие с растениями гетерологичные гены на векторах, созданных для других бактерий. Трансформация плазмидной р1 и хромосомной маркеры кр, Ыб, Кшг ДНК была осуществлена с эффективностью 4 и 2 на 1 мкг ДНК соответственно Яблуненко, Муронец, Каменева, . Ранее трансформация плазмидной ДНК была описана только для вирулентного вида агробактерии А. Частота трансформации в этом случае составляла ЮМ О3 трансформантов на 1 мкг ДНК Ькеп, ii, . Применение метода электропорации у АдгоЬасегит гасюЬасег позволило увеличить частоту трансформации в 5 раз в случае плазмидной ДНК и в 0 раз в случае хромосомных генов до 5,0x4 и 9,5x3 на 1 мкг ДНК соответственно. При помощи электропорации в клетки А. Ьаег 1 были введены не только мелкие, но и крупные плазмиды с клонированными в них гетерологичными генами. С помощью трансформации хромосомных генов с электропорацией было доказано сцепление индуцированных транспозоном Тп5 и изменяющих поверхностные клеточные структуры,участвующие во взаимодействии с корнями растений, мутаций Са1 с маркером транспозона Кшг Яблуненко и др. Таким образом, на современном этапе изучения генетического контроля и молекулярных механизмов взаимодействия почвенных бактерий с растениями и азотфиксации в ассоциации могут успешно использоваться методы трансформации. ТРАНСДУКЦИЯ. Особенность трансдукции заключается в том, что размер переносимого фрагмента бактериальной ДНК ограничивается емкостью фаговой головки и не превосходит 1 генома бактерии. Это обстоятельство позволяет использовать трансдукцшо для выяснения детальной генетической организации бактериальных геномов. ii i, способствует созданию векторных систем для клониравания симбиотических генов ii. ОБЩАЯ ТРАНСДУКЦИЯ. Трансдукция фрагментов хромосомы клубеньковых бактерий. Первый бактериофаг, осуществляющий трансдукшио у ii, был излирован М. Ковальским i, из лизогенного штамма ii ii клубеньковые бакгерии люцерны. Автор изучил умеренный бактериофаг . В дальнейшей работе широко использовался бактериофаг 5, оказавшийся способным трансдуцировать широкий круг бактериальных маркеров. Впоследствии появились сообщения о выделении трансдуцирующих фагов у . .i клубеньковые бактерии гороха и i клубеньковые бакгерии сои i, , iv, i, v, i . i, , , . Новикова, Симаров, . Наиболее подробно трансдуцирутощие бактериофаги были изучены у клубеньковых бактерий люцерны. Среди фагов, осуществляющих общую трансдукцию у . Частоты трансдукции у различных штаммов варьировали в пределах 1Г8 и зависели не только от свойств самого фага, но и от особенностей реципиентного штамма и переносимого фрагмента ДНК. Не было обнаружено трансдукции хромосомных генов у штаммов, дефектных по рекомбинации гесАмутанты, однако частоты трансдукции у них плазмидных маркеров не отличались от частот, наблюдаемых при использовании в качестве реципиентов штаммов дикого типа i . Эти результаты свидетельствуют о различных механизмах трансдукции у клубеньковых бактерий хромосомных генов и плазмид. Изучение морфологии вирионов трансдуцирующих фагов ii показало, что среди них встречаются фаги, напоминающие фаг лямбда фаги 5,,2, фаг Т4 . О М или Р ii фаг i, i . Новикова, Симаров, .