Генетическая детерминация и механизмы модификационной изменчивости в онтогенезе гипоталамического несахарного диабета

• Автор: Хегай, Игорь Ильич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 323 с. : ил

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Гипоталамический несахарный диабет.

1.2. Молекулярногенетический контроль синтеза вазопрессина

1.3. Структура молекулы вазопрессина .

1.4. Внутриклеточная трансдукция гормонального сигнала вазопрессина . .

1.4.1. Рецепторы вазопрессина.

1.4.2. Амплификация гормонального сигнала в почке.

1.4.3. Белки цитоскелета и рециркуляция аквапоринов.

1.4.4. Нефрогенный несахарный диабет

1.5. Структура и функции почечных канальцев

1.6. Системные эффекты вазопрессина.
1.6.1. Центральное звено осморегулирующего рефлекса.
1.6.2. Взаиморегуляция нейросекреторных и иммунных процессов
1.6.3. Координация механизмов кортикостероидной регуляции и осморегуляции.
1.7. Критические периоды в онтогенезе
1.8. Заключение по обзору литературы .
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Экспериментальные животные.
2.2. Аналитические методы
2.2.1. Микроколоночная хроматография белков нейрогипофиза.
2.2.2. Определение оксикортикостероидов.
2.2.3. Определение концентрирующей способности почек
2.2.4. Определение гуморального иммунного ответа.
2.3. Ферментативная микродиссекция почечных канальцев.
2.4. Нозерн блот анализ мРНК сократительных белков цитоскелета
2.5. Иммуноблоттинг белков почки
Глава 3. Гибридологический анализ наследования гена
i iii
3.1. Параметры питьевого поведения у крыс линии
3.2. Фенотипическое проявление мутантного гена i iii у крыс и критерии генотипирования по фенотипу
3.3. Локализация гена i iii на генетической карте крысы
vi.
3.4. Физическое картирование гена i iii на метафазных хромосомах крысы vi .
3.5. Норма реакции мутантного гена i iii у гомозиготных крыс линии .
Глава 4. Фенотипическое проявление гена i в онтогенезе
4.1. Плейотропные физиологические эффекты мутантного гена i, детерминирующего развитие несахарного диабета у крыс.
4.2. Взаимодействие гена i с генами почечных белков.
4.2.1. Анализ специфических белков почки при длительной дегидратации и гипергидратации.
4.2.2. Взаимодействие генов почечного белка 0 кДа и
вазопрессина в постнатальном онтогенезе.
4.2.3. Межлинейные особенности экспрессии гена белка 0 кДа во внутреннем мозговом веществе почки .
4.2.4. Зональное распределение актинина и тропомиозина в почке
4.2 5. Вазопрессинспецифичные фосфорилируемые белки в почечных
канальцах
Глава 5. Модификация осморегулирующей функции внешними воздействиями в раннем онтогенезе
5.1. Динамика уровня оксикортикостероидов в крови после введения различных доз ацетата гидрокортизона .
5.2. Модификация функции осмотического концентрирования у крыс линии воздействием глюкокортикоидными гормонами в раннем онтогенезе.
5.3. Модификация рецепции вазопрессина в собирательных трубках у крыс линии , подвергшихся воздействию гидрокортизоном в раннем постнатальном периоде
5.4. Осмотическое концентрирование у крыс линии , подвергшихся воздействию гидрокортизоном в раннем онтогенезе.
Глава 6. Обсуждение результатов.
6.1. Гибридологический анализ
6.2. Возрастная динамика мутантного фенотипа.
6.3. Дестабилизация осморегуляции и модификационная изменчивость . .
Общее заключение
Выводы
Список литературы


Насыщение мест фиксации и максимум активности, в частности, аденилатциклазы в почке должны наблюдаться при одинаковой концентрации гормона. Наконец, в серии с использованием аналогов гормона уровень фиксации должен коррелировать с уровнем активации аденилатциклазы Тлдд1е, . Кинетика взаимодействия гормона с рецептором описывается уравнением, аналогичным уравнению МихаэлисаМентен для ферментсубстратных комплексов. Отношение констант скорости ассоциации и скорости диссоциации равно константе диссоциации. Данный параметр характеризует стабильность гормонорецепторного комплекса и определяется по кинетическим превращениям в ходе установления равновесного состояния между гормоном и рецепторами. Константа диссоциации численно равна концентрации гормона, при которой устанавливается равновесие на уровне половины связанных с гормоном рецепторов. Величина, обратная константе диссоциации константа ассоциации, вычисляется экспериментальным путм по наклону прямого участка кривой связывания гормона, построенной в координатах Скэтчарда Доис, . Константа диссоциации численно зависит от способа измерения гормонального эффекта в конкретной физиологической реакции. К0 активации аденилатциклазы аргининвазопрессином в собирательных трубках почки крысы варьировала в отдельных экспериментах от 0,2 до 3,0 нМ 1тЬег1ТеЬои1 а1. В первичной культуре крысиных клеток аорты Ко связывания аргининвазопрессина равна ,0 нМ, а видоспецифичный лизин8вазолрессин свиньи в этих условиях связывается хуже, с константой диссоциации, равной ,0 нМ РепК е а. М аргининвазопрессина уже через две минуты гормон фиксируется на рецепторных мест. Динамическое насыщение устанавливается через минут, и это время коррелирует с моментом развития максимального физиологического ответа. При увеличении концентрации гормона до 1,0 мМ насыщение рецепторов происходит через 4 минуты i . Гормональные эффекты вазопрессина на уровне клетки реализуются через специфичные мембранные рецепторы и универсальные системы амплификации сигнала. Усиление гормонального сигнала достигается за счт синтеза ферментами, локализованными на внутренней стороне базолатеральной мембраны, низкомолекулярных вторичных посредников цАМФ, цГМФ, инозотол 1,4,5трифосфата и 1,2диацилглицерола. У млекопитающих выявлено три класса рецепторов вазопрессина, имеющих общую структурную организацию, но различающихся по аминокислотному составу, локализации и механизму трансмембранной передачи гормонального сигнала. Рецепторы Ла располагаются на плазматических мембранах гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, тромбоцитов, гепатоцитов, лимфоцитов и тимоцитов . В гипофизе локализованы рецепторы Vi i, i . Рецепторы типа V2 определяются исключительно на канальцах медуллярной зоны почки i . На выступающем наружу конце всегда выявляется не менее одного сайта гликозилирования, внутриклеточные петли и Сконец содержат потенциальные сайты фосфорилирования протеинкиназами А и С. В составе второго трансмембранного домена локализована консервативная аминокислота , имеющая ключевое значение для взаимодействия с белками ii, , . Полноразмерный ген Ла рецептора вазопрессина человека был выделен из геномной библиотеки на основе 4 и субклонирован в составе 6,4 т. I фрагмента ii . Выявлены два экзона, разделнные интроном длиной в 2,2 т. Экзон 1 содержит пар оснований 5 нетранслируемой области и текст для первых 3 аминокислот открытой рамки считывания. АТТАААА в позициях и . В 5 нетранслируемой области обнаружены консенсусные последовательности потенциальных транскрипционных регуляторных элементов цисдействия бокс, АР1, , , I6. Ещ один микросателлит i, присутствует в интроне. Эти последовательности могут быть использованы в качестве маркров гена. Ген Viрецептора вазопрессина человека был картирован на сегменте длинного плеча хромосомы ii . Анализ суммарной мРНК выявил в е составе только один транскрипт гена V1 размером в оснований. Наиболее высокий уровень экспрессии гена рецептора вазопрессина Vi зафиксирован в гепатоцитах и в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов. Рис.