Обнаружение и функциональное исследование нейропептидов, гомологичных пептидам CNP улитки Helix lucorum L., в нервной системе других беспозвоночных

• Автор: Асеев, Николай Александрович
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологически активные пептиды в нервной системе беспозвоночных.

1.1.1. Нейропептиды семейства СЫР.

1.1.2. Эволюционый аспект функционирования нейропептидов

1.2.0бщее строение медицинской пиявки

1.2.1. Нервная система медицинской пиявки.

1.2.1.1. Идентифицированные нейроны сегментарных ганглиев.

1.2.1.2. Идентифицированные нейроны субэзофагеального ганглия

1.2.2. Лакунарная сосудистая система медицинской пиявки.
2. МЕТОДИКА
2.1. Животные и препарирование.
2.2. Иммуноблоттинг
2.3. Иммуногистохимия
2.4. Электрофизиология.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Поиск гомологичных СЫР полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов
3.2. Поиск СЫРиммунореактивных клеток в нервной системе
медицинской пиявки
3.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы
медицинской пиявки v
3.2.1.1.Исследование различий в уровне иммунореакции
при окрашивании антителами к пептидам СЫР4 и СКР2.
3.2.1.2.Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции.
3.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы
медицинской пиявки на последовательных срезах
3.3. Идентификация СЫРиммунореактивных клеток в нервной системе пиявки.
3.3.1. Анализ распределения СЫРиммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов
3.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуорссцснтных ориентиров.
3.3.3. Исследование природы СМРиммунореактивности
в межсегментарных коннективах
3.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки
3.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия.
3.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев.
3.3.5. Идентификация СЫРиммунореактивных нейронов 4,
и 7 сегментарных ганглиев.
3.4. Исследование физиологических эффектов пептида СЫР4 в нервной системе пиявки
3.4.1. Аппликация пептида СЫР4 в модели сенситизации моносииаптических ответов
3.4.2. Аппликация пептида С4 на полуинтактных препаратах сердцемозг
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Поиск гомологичных полипептидов в белковых фракциях,
выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов
4.2. Поиск СЫРиммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки.
4.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки v
4.2.1.1. Исследование различий в уровне иммунореакции
при окрашивании антителами к пептидам СЫР4 и СИР2.
4.2.1.2. Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции
4.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах
4.3. Идентификация СЫРиммунореактивных клеток в нервной системе пиявки.
4.3.1. Анализ распределения СЫРиммунореактивных клеток в нервной
системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов.
4.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентных ориентиров
4.3.3. Исследование природы СЫРиммунореактивности
в межсегмснтарных коннективах
4.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки
4.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия.
4.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев.
4.3.5. Идентификация СЫРиммунореактивных нейронов 4,
и 7 сегментарных ганглиев
4.4. Исследование физиологических эффектов пептида СЫР4 в нервной
системе пиявки
4.4.1. Аппликация пептида СЫР4 в модели сенситизации
моносинаптических ответов
4.4.2. Аппликация пептида СЫР4 на полуинтактных препаратах
сердцемозг.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


В основном, нейропептиды выбрасываются в синаптическую щель вместе с основным медиатором и играют модулирующую роль меняют временные или амплитудные параметры ностсинаптического ответа, влияют на выброс медиатора из прссинаптической терминали. Кроме того, нейропептиды могут распространяться далеко от места секреции, в таком случае их обычно называют нейрогормонами. Действуя как модуляторы синаптических связей и нейрогормоны, пептиды участвуют в сложнейших функциях нервной системы и организма в целом. Для примера можно привести пептид , участвующий в организации пищевого поведения у человека . Нейропептиды могут иметь одинаковую или близкую структуру у беспозвоночных и млекопитающих. Одной из недавно открытых групп нейропептидов является семейство i, предсказанное по нуклеотидной последовательности гена II2 и после обнаруженное иммунохимическими методами в ЦНС виноградной улитки ix . Эти пептиды локализованы в нейронах сети оборонительного поведения улитки ген I был выделен из командных нейронов этой сети также недавно было исследовано распределение пептидов в ЦИС другого моллюска, i ii Ii . Изучение функций пептидов только началось, однако уже показана их функция в модуляции оборонительной моторной программы, а также нейроростовые свойства Коршунова и др. На данный момент неизвестно, ограничивается ли распространение семейства нейропептидов нервной системой моллюсков или они свойственны также нервной системе других беспозвоночных животных. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является поиск и исследование представителей нового семейства нейропептидов в разных группах беспозвоночных животных. Выяснить, являются ли пептиды уникальными для ЦНС улитки, или же гомологичные им пептиды присутствуют также в нервной системе других беспозвоночных животных. Выяснить, какие клетки нервной системы содержат гомологичные пептиды являются ли эти пептиды неспецифическими маркрами всех клеток нервной ткани, локализованы в определнных клеточных типах например, в глии или мотонейронах или образуют ещ более специфичный паттерн распределения. Провести сравнительный анализ паттерна иммунореактивных клеток с картами идентифицированных клеток, известными для некоторых беспозвоночных. Охарактеризовать и но возможности идентифицировать иммунореактивные клетки, которые не обозначены на таких картах. Так как, исходя из структуры, являются секретируемыми пептидами, то возникает задача проверить эффекты аппликации синтетических пептидов на нервную систему в физиологических концентрациях. Научная новизна работы. Нами впервые показано широкое распространение пептидов, гомологичных пептидам улитки, в нервной системе беспозвоночных, не принадлежащих к типу . С использованием иммуногистохимической техники окрашивания клеток, в ганглиях центральной и периферической нервной системы медицинской пиявки, i i i у были впервые обнаружены иммунореактивные нейроны на основе анализа большого количества препаратов нами была построена суммарная схема распространения таких нейронов в нервной системе пиявки. В нервной системе пиявки так же, как и в ЦНС виноградной улитки паттерн локализации иммунореактивных нейронов высокоспецифичен пептиды выявляются в строго определнных кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов. Благодаря правильно выбранному объекту исследования медицинская пиявка является классической нейробиологической моделью удалось продолжить исследование иммунореактивных нейронов и на уровне клеточной физиологии. В работе впервые предпринята попытка выяснить функции иммунореактивных нейронов и определить мишени биологического действия гомологичных пептидов в организме представителя типа i, пиявки i iii. Электрофизиологическими методами мы идентифицировали часть нервной сети иммунореактивных интернейронов 4. В нашем исследовании не было обнаружено влияния пептида 4 на фасилитацию двух известных моносинаптических связей. Были показаны тормозные модулирующие эффекты на сердце и возбуждающие его мотонейроны. Существование физиологических эффектов подтверждает выдвинутую нами гипотезу о широком распространении пептидов семейства в нервной системе беспозвоночных животных.