Клеточная специфичность регуляции экспрессии рецепторов пролактина в печени крыс

• Автор: Богорад, Роман Львович
• Шифр специальности: 03.00.13, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с.

ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. РЕАЛИЗАЦИЯ ЭФФЕКТОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ ПЕЧЕНИ литературный обзор

1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ

1.1.1. Строение печени, ее клеточный состав

1.1.2. Физиологические функции печени. Участие различных клеточных элементов

1.1.3. Функции клеток печени при развитии некоторых патологическихкомпенсаторных состояний

1.1.3.1. Регенерация печени

1.1.3.2. Фиброгснез

1.1.3.3. Холсстаз

1.2. ФУНКЦИИ ПРОЛАКТИНА

1.2.1. Общие положения.

1.2.2. Секреция пролактина.
1.2.3. Функции пролактина
1.2.4. Действие пролактина на отдельные клеточные элементы печени
1.2.4.1. Действие на гепатоциты
1.2.4.2. Действие на холангиоцнты
1.3. РЕЦЕ1ТОРЫ 1РОЛАКТИА И РЕАЛИЗАЦИЯ ЕГО ЭФФЕКТОВ
1.3.1. Особенности строения рецептора пролактина.
1.3.2. Строение гена рецептора пролактина и его транскрипция.
1.3.3. Сравнительный анализ изоформ рецептора пролактина млекопитающих. Механизмы образования.
1.3.4. Механизм действия пролактина через собственные рецепторы
1.3.4.1. Димеризация рецепторов
1.3.4.2. Участие внутриклеточных бел ковпосредников в проведении сигнала рецепторов пролактина
1.3.4.3. Интернализация и ядерная транслокация.
1.3.4.4. Роль короткой и длинной форм рецептора пролактина в проведении сигнала.
1.3.4.5. Процессинг рецептора
1.3.5. Регуляция экспрессии мРНК рецептора пролактина
1.3.5.1. Уровень рецепторов пролактина. Регуляция гранскрипции
1.3.5.2. Регуляция альтернативного сплайсинга премРНК рецептора пролактина соотношения короткой и длинной изоформ.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ.
2.1.1. Животные
2.1.2. Реактивы
2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
2.2.1. Хирургические операции
2.2.1.1. Индуцированный обструктивный холестаз.
2.2.1.2. Кастрация самцов
2.2.1.3. Овариэктомия самок
2.2.2. Введение препаратов.
2.2.3. Приготовление препаратов клеток и тканей для анализа
2.2.3.1.одготовка тканей для иимуногистохимического анализа
2.2.3.2. Подготовка ткани печени для ПЦРанализа.
2.2.3.3. Разработка способа дифференциального выделения гепатоцитов
и холангиоцитов
2.2.4. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина в тканях крыс
2.2.4.1.риготовленис срезов
2.2.4.2. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина.
2.2.5. Цитофогомерическое определение интенсивности ПрлРпозитивного окрашивания.
2.2.6. Выделение РНК из тканей и изолированных клеток.
2.2.7. Синтез первой цепи на выделенной РНК.
2.2.8. Введение метки в олигонуклеотиды.
2.2.9. Постановка полимеразной цепной реакции.
2.2 ДНКблотинг Саузернгибридизация
2.2 Клонирование фрагментов короткой и длинной изоформ рецепторов пролактина
2.2 Разработка метода полуколичественной оценки уровня мРНК рецептора пролактина и соотношения его короткой и длинной изоформ с использованием внутреннего стандарта.
2 Уровень мРНК рецепторов пролактина.
2 Соотношение и уровень мРНК короткой и длинной изоформ рецепторов пролактина.
2 Обоснование контрольной группы.
2.2 Разработка метода количественного сопоставления уровня мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах с использованием
внешнего стандарта
2.3. ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ.
2.3.1. Разработка метода математической оценки активности пролактининдуцированных сигнальных каскадов в тканях крысы, на основе измеренных уровня мРНК рецепторов пролактина и соотношении его изоформ.
2.3.1.1. Формулировка модели
2.3.1.2. Верификация модели.
2.3.2. Статистическая обработка данных.
Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ РАЗНОГО ТИПА САМОК КРЫС
3.1. СУБКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЛРСПЕЦИФИЧНОЙ
ОКРАСКИ .
3.2. ЯИЧНИКИ
3.2.1. Фолликулы яичников.
3.2.2. Желтые тел а.
3.3. МАТКА
3.4. ГИПОФИЗ И ГИПОТАЛАМУС
3.5. ПЕЧЕНЬ.
Глава 4. УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ЕГО ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И
ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫСЫ В НОРМЕ
Глава 5. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ КРЫС
5.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ I ОРМОНОВ НА ГЕПАТОЦИТЫ.
5.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА ХОЛАНГИОЦИТЫ
Глава 6. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА
УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ
ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ КРЫС
6.1. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ГЕПАТОЦИТЫ.
6.2. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ХОЛАНГИОЦИТЫ Глава 7. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА ГЕПАТОЦИТЫ И ХОЛАНГИОЦИТЫ В РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ.
7.1. ГЕПАТОЦИТЫ.
7.2. ХОЛАНГИОЦИТЫ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Необходимыми предпосылками решения дальнейших задач являлись, вопервых, отработанный в рамках настоящего исследования метод одновременного выделения гепатоцитов и холангиоцитов в виде фрагментов желчных протоков с проверкой качества разделения по дифференциальным маркерам и, вовторых, отработанный нами полуколичественный метод определения уровня рецепторов пролактина и соотношения его изоформ на уровне мРНК, основанный на анализе накопления продуктов конкурентной полимеразной цепной реакции с применением внутреннего стандарта i , . РНК ПрлР и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс. Поскольку прямая экспериментальная проверка эффективности и характера действия пролактина на клетки крайне затруднительна, а при описании состояний i viv и практически не возможна, необходимо было разработать альтернативный подход оценки вклада различных клеточных элементов печени в общий пролатининдуцированный ответ печени на пролактин на основании уровня мРНК рецепторов пролактина и уровней мРНК его изоформ. Таким подходом стала, разработанная нами, математическая модель для расчета эффективности действия пролактина на клетки и ее зависимости от уровня изоформ. Данная модель позволяет сопоставить не только уровень рецепторов пролактина и соотношение его изоформ с описанными в литературе результатами оценки интенсивности пролакгининдуцированных каскадов л vi, но анализировать новые экспериментальные данные. Использование настоящей модели и полученные данные об уровне изоформ в разных типах клеток позволили нам оценить вклад гспатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных пролактининдуцируемых каскадов у крыс разного пола в норме. Кроме того, при использовании данных о действии половых гормонов и обструктивного холесгаза на уровень мРНК рецепторов пролактина и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холаигиоцитах самок и самцов крыс, нами установлена степень влияния этих параметров на эффективность действия пролактина в зависимости от типа клеток печени. В результате проведенной работы получены новые данные, позволяющие сопоставить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных эффектов пролактина в печени при различных функциональных состояниях. Установлено, что холангиоциты отличаются от гепатоцитов в норме не только существенно более низким уровнем мРНК рецепторов пролактина, но и обратным соотношением их изоформ в холаигиоцитах, как и большинстве тканей преобладает длинная изоформа рецептора, в гепатоцитах короткая. Показано, что в отличие от большинства тканей в холаигиоцитах половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК рецепторов пролактина, ни на соотношение его изоформ. Продемонстрировано также, что обструктивный холестаз является независимым от половых гормонов фактором регуляции экспрессии рецепторов пролактина, дифференциально действующим на разные клеточные элементы печени. В холаигиоцитах он, в первую очередь, повышает общий уровень мРНК рецептора, а в гепатоцитах преимущественно влияет на соотношение изоформ. Математическая оценка интенсивности пролактининдуцируемых каскадов, позволила заключить, что в печени интакных крыс и гепатоциты, и холангиоциты с равной эффективностью проводят сигнал пролактина, опосредованный активацией тирозинкиназ Януса, однако преобладают, повидимому, тканеспецифические сигналы, которые реализуются через короткую изоформу рецептора, доминирующую в гепатоцитах. Математическая модель высветила существенные половые отличия сдвига пролактининдуцируемых каскадов в гепатоцитах при обструктивном холестазе. Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут иметь значение для фундаментальной эндокринологии, так как не только расширяют представления о характере экспрессии рецепторов пролактина и их изоформ в основных клеточных элементах печени при различных функциональных состояниях, но и позволяют оценить на основе этих данных соотношение и интенсивность эффектов пролактина, реализуемых через разные клеточные элементы, и их вклад в реализацию эффектов в целой печени. Практическая значимость полученных данных заключается в развитии представлений о половых отличиях в протекании патологических процессов в печени, например, индуцированных обструктивным холестазом, что создает основы для полспецифическою фармакологического воздействия.