Активность промотора гена пататина класса I картофеля в условиях гомологичной и гетерологичной экспрессии

• Автор: Наумкина, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 187 с. : ил.

Введение

Литературный обзор

I. Генетическая инженерия растений достижения практического применения и значение для фундаментальных исследований

1.1 Проблема биобезопасности трансгенных растений

1.2 Основные методы трансформации растений

1.2.1 Способы генетической трансформации растений с использованием i i

1.3 Стратегия и методология создания трансгенных растений

1.4 Назначение и практическое применение репортерных генов

1.4.1. Репортерный ген

II. Регуляторная зона гена

II. 1 Промоторы трансгенов

II.2 Экспрессия чужеродных генов в трансгенных растениях
II.3 Специфическое метилирование промотора как регуляция активности гена
II.4 Регуляция активности генов сахарами
III. Главный запасной белок клубней картофеля пататин
III. 1 Основные функции белка пататина
III.2 Мультикопийное семейство генов, кодирующих пататины
III.3 Особенности экспрессии основных классов генов пататина
III.4 Структурные особенности промотора гена пататина класса I
Материалы и методы исследований
1. Реактивы
2. Объекты исследований
2.1 Модельная система на основе трансгенного картофеля
2.2 Модельная система на основе трансгенного арабидопсиса
2.3 Размножение и поддержание коллекции трансформантов картофеля
3. Выделение и анализ ДНК
3.1 Выделение растительной ДНК
3.1.1 Дополнительная очистка растительной ДНК
3.2 Проверка качества выделенной ДНК
3.3 Определение концентрации ДНК в образцах
3.4 Проведение полимеразной цепной реакции
3.5 Метод идентификации на олигонуклеотидном биочипе
3.6 Получение плазмидной ДНК
3.6.1 Получение компетентных клеток
3.6.2 Трансформация . i
3.6.3 Микровыделение плазмидной ДНК
3.6.4 Макровыделение плазмидной ДНК
4. Анализ метилирования цитозина ВЗЗпромотора у картофеля
4.1 Проведение полимеразных цепных реакций
4.2 Подбор и использование рестриктаз
4.3 Подбор количества контрольной ДНК для рестрикционного анализа
4.4 Рестрикционный анализ пататинового промотора в составе растительной ДНК
4.4.1 Анализ степени метилирования сайтов методом ПЦР
4.4.2 Анализ степени метилирования сайтов методом блоттинга
5. Определение активности гена
5.1 Гистохимическое окрашивание органов картофеля и проростков арабидопсиса с помощью XI
5.2 Флюориметрический метод
6. Определение количества белка методом
7. Световая микроскопия
8. Определение органной специфичности работы промотора
9. Исследование влияния различных условий выращивания на функционирование пататинового промотора
. Изучение влияния экзогенных сахаров на активность промотора ВЗЗ
. Анализ действия фитогормонов
. Статистическая обработка данных
Результаты
I. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного картофеля
1. Доказательство трансгенности растений
2. Анализ специфичности функционирования промотора ВЗЗ
2.1 Органная специфичность
2.2 Тканевая специфичность
2.3 Зависимость от возраста
2.3.1 Влияние возраста листьев
2.3.2 Влияние возраста растений
3. Анализ влияния условий выращивания трансформантов картофеля на активность пататинового промотора
3.1 Влияние световых условий выращивания
3.2 Влияние сахарозы
3.2.1 Выращивание трансформантов на свету
3.2.2 Выращивание в темновых условиях
4. Анализ влияния экзогенных сахаров на активность пататинового промотора в изолированных листьях
4.1 Влияние сахарозы
4.2 Сравнение влияния сахарозы, глюкозы и фруктозы
II. Анализ возможных молекулярных механизмов органной специфичности ВЗЗпромотора. Роль метилирования промоторной ДНК
1 Анализ степени метилирования ВЗЗпромотора методом ПЦР
1.1 Подбор и анализ рестриктаз
1.2 Подбор условий ПЦР на контрольной ДНК и рестрицированной ДНК
1.3 Сравнительный анализ доступности ДНК из разных органов картофеля
1.4 Рестрикция ВЗЗпромотора метилчувствительной рестриктазой АсИ
2 Анализ степени метилирования сайтов ОСОв методом БоиЛетблотинга
III. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного арабидопсиса
1. Определение органной специфичности работы промотора ВЗЗ
2. Влияние света и темноты на активность пататинового промотора
3. Изучение влияния экзогенных сахаров на активность пататинового промотора
3.1 Анализ действия сахарозы
3.2 Гистохимический анализ действия сахарозы на активность пататинового промотора
3.3 Анализ влияния глюкозы и фруктозы
3.4 Кинетика ответной реакции на сахара
4. Исследование возможного влияния фитогормонов на активность пататинового промотора
Обсуждение
Выводы
Список цитируемой литературы


Кроме того, найдены новые классы белков i iii, которые токсичны не только для насекомых, но и для других вредителей, таких как нематоды, клещи и одноклеточные паразитирующие микроорганизмы Бурьянов, . В настоящее время так называемые Яграстения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США. Кроме того, фирмы и ii предлагают для практического использования трансгенные формы томатов и картофеля, устойчивые к насекомым Кучук, Глеба, . Другой подход к созданию трансгенных растений, устойчивых к вредителям и фитопатогенным грибам это экспрессия в клетках растений геновингибиторов протеиназ. Многие растения содержат в своих тканях, плодах и семенах ингибиторы протеиназ, специфически настроенных против протеиназ насекомых и грибов Бурьянов, . Для создания растений, устойчивых к вирусам, применяют несколько подходов. Один из них основан на конструировании антисмысловых i конструкций. В таких конструкциях кДНКовая копия вирусной РНК ставится под промотор таким образом, чтобы в результате транскрипции образовалась последовательность РНК, комплементарная вирусной. При заражении вирусом трансгенной растительной клетки, и накоплении вирусной РНК образуются РНКовые дуплексы с конститутивно синтезируемой антисмысловой РНК. Такие дуплексы разрушаются специфическими РНКазами, в результате не происходит новообразование вирусных частичек и развития болезни. Активный синтез такого белка, обладающего большим сродством к РНК вируса, не дает возможности последней активно реплицироваться в клетке хозяина, что приводит к достаточно высокой устойчивости трансформантов к вирусам Кучук, Глеба, . Для защиты растений от вирусной инфекции также используются кДНК вирусных сателлитных РНК, гены вирусных репликаз и другие элементы вирусного генома Бурьянов, . На первых этапах работ по конструированию трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам, наиболее широко использовали гены гидролитических ферментов, разрушающих клеточные стенки фитопатогенных микроорганизмов. В первую очередь это бактериальные, грибные и индуцибельные растительные гены хитиназы. Были получены трансгенные растения табака, устойчивые к грибковой инфекции, путем встраивания в растительный геном гена хитиназы риса совместно с геном глюканазы люцерны Кучук, Глеба, . Другой подход для создания трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам заключается в использовании генов, участвующих в синтезе фитоалексинов. Кучук, Глеба, . Полученные растения синтезировали фитоалексин резвератрол, олигомерная форма которого, винеферин, токсична для фитопатогенных грибов Бурьянов, . Трансформанты обладали повышенной устойчивостью к грибному патогену i i. Еще один подход для защиты растений от грибных патогенов заключается в создании трансгенных растений с искусственной гиперчувствительной реакцией, приводящей к некрозу инфицированных тканей растений. Для этой цели использовали генетические конструкции, содержащие ген бактериальной рибонуклеазы барназы под контролем промотора индуцибельного гена картофеля ргр1, ответственного за быстрый локальный ответ на инфицирование патогеном. Так был получен трансгенный картофель, устойчивый к фитофторе. В условиях заражения экспрессия гена барназы приводит к быстрой гибели инфицированной клетки. Для сведения к минимуму некротического эффекта барназы на соседние неинфицированные ткани, а также чтобы исключить спонтанную экспрессию этого гена в геноме растений, в трансформантах конститутивно экспрессировался также ген барстар. Продуктом этого гена является специфический ингибитор барназы Бурьянов, . Устойчивые к патогенам растения накапливают такие химические соединения, как перекись водорода, салициловая кислота , фитоалексины. Примером, доказывающим важную роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений, являются трансгенные растения табака, содержащие бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы фермента, разрушающего и неспособные к иммунному ответу.