Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) с использованием семядольных эксплантов

• Автор: Белоногова, Марина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематика и происхождение, ботаническое описание и особенности биологии льнадолгунца

1.2. Основные направления и проблемы селекции льнадолгунца

1.3. Биотехнологические способы создания генетического разнообразия льна.

1.4. Морфогенетический ответ растений рода i

1.4.1.Физиологический контроль морфогенеза i vi.

1.4.1.1 .Зависимость морфогенеза от источника экспланта.

1.4.1.2. Зависимость морфогенеза от генотипа растениядонора

1.4.1.3. Зависимость морфогенеза от состава среды.

1.4.2. Получение новых форм растений в роде i методами культуры тканей.

1.4.3. Растительные протопласты в качестве источника новых форм растений рода i
1.4.4. Эмбриокультура и культура пыльников в качестве источника новых форм растений рода i.
1.5. Получение новых форм растений методами генетической инженерии.
1.5.1. Использование селективных генов при трансформации клеток растений.
1.5.2. Репортерные системы и возможности их применения в генетической трансформации.
1.5.3. глюкуронидаза .i одна из наиболее распространенных репортерных систем
1.5.4. Получение трансгенных растений рода i
I.6. Заключение
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II.1. Реактивы, использованные в работе
.2. Растительный материал
.3. Среды для культивирования растений и растительных тканей
.4. Получение проростков i vi в качестве источника эксплантов
.5. Регенерация растений.
.6. Укоренение растенийрсгенерантов.
.7. Исследование морфологии растений и цветка
.8. Бактериальные штаммы и среды для выращивания бактерий.
.9. Трансформация растений.
Анализ трансформированных растений
II. .1. Тестирование по росту в селективных условиях.
II. .2. Методы молекулярной биологии.
II. .2.1. Выделение тотальной ДНК
И. .2.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
И2.3. Электрофоретические методы.
II. .3. Анализ экспрессии встроенного репортерного гена
II. .3.1. Гистохимический метод определения активности глюкуронидазы
II. .3.2. Флуориметрическим метод определения активности Вглюкуронидазы.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.1. Стерилизация семян и получение проростков i vi.
1.2. Обоснование выбора эксплантов
1.3. Изучение и оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность семядольных эксплантов льнадолгунца
1.3.1. Подбор оптимального физиологического возраста экспланта
1.3.2. Изучение влияния генотипа и соотношения регуляторов роста в питательной среде.
1.3.3. Изучение влияния способов предварительной обработки эксплантов
1.3.4. Изучение влияния соотношения регуляторов роста в питательной среде при различном физиологическом возрасте экспланта
1.3.5. Изучение влияния негормональных компонентов питательной среды.
1.3.6. Изучение влияния абсцизовой кислоты
1.3.7. Укоренение и вегетативное размножение
1.3.8. Морфология растенийрегенерантов.
1.4. Получение трансгенных растений льнадолгунца.
1.4.1. Влияние антибиотиков на каллусо и побегообразование на эксплантах трансформированных растений.
1.4.2. Трансформация растений.
III.4.2.1. Влияние времени взаимодействия с агробактерией на частоту трансформации.
Ш.2.2.2. Влияние используемой генетической конструкции на частоту
трансформации.
Ш.4.3. Анализ растений трансформантов
Ш.4.3.1. Повторное тестирование растений на устойчивость к Км
Ш.4.3.2. Анализ ДНК трансформированных растений.
Ш.4.3.3. Определение экспрессии гена рглюкуронидазы
Ш.4.4. Морфологические особенности трансгенных растений.
Ш.4.5. Изучение наследования встроенных генов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Широкие возможности для решения этих проблем открывают биотехнология и генетическая инженерия, методы которых позволяют включать в геном растений чужеродные гены, изменяя свойства растений. Хотя лен в культуре i vi известен около лет , , , , , . Поляков и др. Каляева и др. Поляков, , i, i . В настоящее время активно исследуют, в основном, лен масличный, у которого достаточно легко образуются растениярегенеранты. Однако применение для льнадолгунца методов регенерации и генетической трансформации, основанных на уже разработанных системах для льна масличного, дают низкую частоту образования побеговрегенерантов и побеговтрансформантов. В нашей стране исследования, связанные с культурой ткани и генетической инженерией льнадолгунца, были начаты в нескольких научных центрах Чикризова, Поляков и др. Егорова, Поляков, Каляева и др. Каляева, Пролетова, Чикризова, Поляков, Пролетова и соавт. В работах, посвященных разработке систем регенерации и трансформации льнадолгунца, в качестве эксплантов, как правило, использовали сегменты гипокотиля, также применяемые при трансформации льна масличного. Однако известно, что при снятии апикального доминирования образование адвентивных почек на гипокотиле льна происходит в основном из эпидермальных клеток , i, , . Поэтому после генетической трансформации огромная часть побегов на сегментах гипокотиля образуется из нетрансформированных клеток, а часть образующихся побегов состоит из трансформированных и нетрансформированных клеток химерные побеги. Поляков и др. Все это делает актуальным разработки надежных, воспроизводимых и высокотехнологичных методов регенерации и трансформации растений льнадолгунца, доступных для широкого круга исследователей и для специалистов сх производства. Мы предположили, что использование иного типа экспланта позволило бы избежать проблемы образования химерных по трансгену побегов после генетической трансформации, которая связана с феноменальной природой образования адвентивных почек на гипокотиле льна. Из литературы известно, что развивающиеся семядоли обладают высоким морфогенетическим потенциалом, так как в них находится большое количество различных гормональных соединений . Хотя в работах других исследователей семядоли проростков льна были охарактеризованы как низкоморфогенные экспланты, мы предполагали, что при использовании методов регенерации, разработанных в нашей лаборатории для семядольных эксплантов других культур, и семядоли проростков льнадолгунца будут способны к высокой степени регенерации. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение трансгенных растений льнадолгунца при использовании семядольных эксплантов. Изучить и оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность семядольных эксплантов льнадолгунца. Исследовать способность к регенерации семядольных эксплантов различных сортов льнадолгунца. Разработать способ агробактериальной трансформации семядольных эксплантов льнадолгунца и получить растениятрансформанты, содержащие репортерные и селективные гены. Доказать трансгенность полученных трансформантов, показав наличие и экспрессию введенных репортерных генов в трансгенных растениях. Показать наследование введенных генов. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработан новый метод регенерации растений льнадолгунца, позволяющий с высокой эффективностью получать побеги на семядольных эксплантах растений разных генотипов. Впервые при использовании семядольных эксплантов льнадолгунца при применении различных конструкций получены трансгенные растения с репортерным геном глюкуронидазы. Впервые для льнадолгунца было показано, что наличие в используемой для трансформации конструкции последовательности внутренней инициации трансляции I, выделенной из генома тобамовируса крестоцветных, вызывало увеличение эффективности трансляции по сравнению с экспрессией гена в линиях трансгенных растений, полученных после трансформации с конструкциями, не имеющими такой последовательности. Разработанная система трансформации может быть использована для получения новых форм льнадолгунца.