Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений

• Автор: Федина, Евгения Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Фитогормоны брассиностероиды.

1.1.1. Структура и функции брассиностероидов.

1.1.2. Молекулярные механизмы действия брассиностероидов в клетках растений

1.2. Фосфорилированиедефосфорилирование белков растений

1.2.1. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода
1.2.2. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции ферментов энергетического метаболизма.
1.2.3. Участие фосфорилирования белков растений в рефляции активности структурных белков.
1.2.4. Участие фосфорилирования белков растений
в регуляции клеточного цикла.
1.2.5. Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений.
1.2.6. Участие фосфорилирования белков в регуляции фотосинтеза.
1.2.7. Участие фосфорилирования белков в регуляции
других процессов клеток растений.
1.3. Тирозиновое фосфорилирование белков растений.
1.3.1. Тирозиновые протеинкиназы и
протеинфосфатазы растений
1.3.2. Роль тирозинового фосфорилирования белков в регуляции функционирования клеток растений
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Определение общего фосфорилирования белков
листьев гороха i i.
2.3. Определение тирозинового фосфорилирования растворимых
белков листьев гороха методом Вестернблотинга с использованием моноклональных антител к фосфотирозиновым белкам
2.3.1. Приготовление образцов.
2.3.2. Метод полусухого блотирования Вестернблотинг
2.3.3. Иммунодетекция тирозинового фосфорилирования белков
2.3.4. Детектирование хемилюминесценции.
2.4. Одномерный электрофорез по методу i
2.5. Двумерный электрофорез.
2.6. Анализ данных, полученных с помощью методов одномерного и двумерного электрофореза.
2.7. Идентификация белков методом I
2.7.1. Трипсинолиз белкового образца
2.7.2. Регистрация массспектров
2.7.3. Идентификация белков.
2.8. Определение содержания перекиси водорода в клетках корней гороха
2.9. Определение содержания оксигенированных производных линолевой кислоты i vi в листьях гороха
2 Определение количества белка в растворе
по методу Бредфорда.
2 Химические реактивы и материалы.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Влияние эпибрассинолида на общее фосфорилироваиие растворимых белков листьев гороха
3.1.1. Временная зависимость действия эпибрассинолида
на общее фосфорилироваиие белков i i
3.1.2. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолидиндуцированном общем фосфорилировании белков
3.2. Влияние эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилироваиие растворимых белков листьев гороха
3.2.1. Изучение специфичности связывания антител
с растворимыми фосфотирозиновыми белками гороха
3.2.2. Временная зависимость влияния эпибрассинолида i i на тирозиновое фосфорилироваиие растворимых
белков листьев
3.2.3. Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз ортованадата натрия и оксида фениларсена i i на тирозиновое фосфорилироваиие
белков листьев гороха.
3.2.4. Участие липоксигеназной сигнальной системы в
эпибрассинолидиндуцированном тирозиновом фосфорилировании белков листьев гороха
3.3. Идентификация белков листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменялось
под влиянием эпибрассинолида
3.4. Влияние эпибрассинолида на содержание перекиси водорода в клетках корней гороха.
3.5. Влияние эпибрассинолида па содержание оксигенированных производных линолевой кислоты
в листьях гороха
Заключение
Список использованной литературы
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АБК абсцизовая кислота
БС брассиностероиды
БСА бычий сыворотчиый альбумин
БФБ 4бромфенилацилбромид
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография 9ГПОД 9гидропсроксиоктадекадисновая кислота ГПОД гидропероксиоктадекадиеновая кислота ДСДЫа додецилсульфат натрия ДТТ дитиотрейтол кДа килоДальтон
МАП К митогенактивируемая киназа Р нитратредуктаза ПААГ полиакриламидный гель ПМСФ фенилметилсульфонилфторид ПСА персульфат аммония
РУБИСКО рибулоза1,5бисфосфат карбоксил азаоксигеназа
СФС сахарозафосфат синтаза
ГЕМЕД тетраметилэтилендиамин
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФАО оксид фениларсен
ФВК ферменты ветвления крахмала
ФЕНК фосфоенолиирувагкарбоксилаза
ФЛА2 фосфолипаза А
ХАПС холамидоиропил диметиламмоний1 пропансульфонат ЭПБ эпибрассинолид СЭК циклинзависимая киназа
МАНГЛТОБ МБ матричная лазерная десорбционноионизационная масс
спектрометрия
Бег серии
ТИгтреонин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Цель проводимых исследований заключалась в выявлении сигнальных систем и идентификации фосфорилированных белков листьев гороха, участвующих в сигналинге брассиностероидов. Исследование влияния эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование белков и вклада протеинкиназ и протеинфосфатаз в уровень их фосфорилированности. Идентификация некоторых выявленных белков, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом. Определение возможности участия липоксш еназной и супероксидсинтазной сигнальных систем в эпибрассинолидиндуцированном фосфорилировании белков. Научная новизна работы. Впервые выявлена регуляция эпибрассинолидом уровня фосфорилирования белков по тирозину, что было вызвано действием эиибрассинолида на активность тирозиновых протеинкиназ и протеинфосфатаз. Впервые показано влияние эпибрассинолида на липоксигеназную и супероксидсинтазную сигнальные системы, о чем свидетельствует повышение содержания оксилипинов, а также эндогенной Н2О2. Впервые методом I идентифицированы белки цикла Кальвина, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом. Научнопрактическая значимость работы. Полученные данные о влиянии эпибрассинолида i фосфорилирование белков растений, в частности на тирозиновое фосфорилирование ряда белков цикла Кальвина, помогут приблизиться к пониманию механизма повышения брассиностероидами фотосинтстичсской активности растений и, в связи с этим, повышения их урожайности. Результаты работы могут быть использованы при подготовке и чтении курсов лекций на кафедрах биохимии и физиологии растений в университетах и сельскохозяйственных ВУЗах. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в гг. КИББ КазНЦ РАИ по теме Взаимодействие сигнальных систем клеток растений. Исследования автора являлись частью работ, проводимых по фантам РФФИ 8, 0, а также по фанту ведущей научной школы. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 6 международной школеконференции молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, м международном конфессе Греция, Международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация Пущино, Х международной конференции молодых ботаников СанктПетербург, II международном симпозиуме Сигнальные системы клеток растений роль в адаптации и иммунитете Казань, , а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ . Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано научных работ, в том числе 4 статьи, две из которых опубликованы в центральных российских научных журналах. Глава 1. Впервые информация о ростстимулирующей активности липидной фракции, выделенной из пыльцы рапса i , которая проявлялась в стимуляции роста в длину второго междоузлия фасоли типично гиббериллиновый эффект одновременно с его искривлением, разбуханием и растрескиванием особый специфический ответ появилась в работе i с сотр. Позднее из липидной фракции пыльцы рапса было выделено кристаллическое вещество стероидной природы, названое брассинолидом, установлено его молекулярное строение v . Рис. Структурная формула брассинолида. В настоящее время в растениях идентифицировано более близких к брассинолиду стероидов, различающихся по структуре и уровням биологической активности. Все эти соединения объединены в одну группу природных полиоксистероидов, называемую брассиностероидами. Они представляют собой производные 5ахолестана и обладают структурным сходством со стероидными гормонами животных эстрогеном, тестостероном, экдизоном. Наиболее высокой физиологической активностью из известных БС обладают три представителя этой группы соединений брассинолид, эпибрассинолид, гомобрассинолид v, i i, Хрипач и др. Способность синтетических аналогов БС в исключительно низких концентрациях стимулировать рост и развитие растений, повышать устойчивость к стрессовым условиям произрастания, увеличивать продуктивность привела к тому, что они нашли практическое применение в растениеводстве , I, , .