Биохимические свойства и функциональная роль протонных насосов вакуолярного типа в проростках кукурузы

• Автор: Шахова, Наталия Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Введение.

Цель и задачи исследования.

Обзор литературы

1.1ГЛТФаза вакуолярного типа

1.1. Биохимическая характеристика НАТФазы тонопласта.

1.2. Субъедпничная организация УАТФазы.

1.3. Изоформы и тканеспецифичность НнАТФазы тонопласта.

2.1Гпирофосфатаза тонопласта

2.1. Биохимическая характеристика Нпирофосфатазы тонопласта.

2.2. Молекулярная организация пирофосфатазы Утипа

2.3. Изоформы и тканеспецифичность БГпирофосфатазы.

2.4. Пирофосфат, как энергетический источник в клетках растений.
3. Физиологическое значение УАТФазы и Упирофосфатазы у растений.
3.1. Влияние засоления на активность протонных насосов тонопласта,
НАТФазу и Н4пирофосфатазу
3.2. Влияние низких температур на активность УАТФазы и Упирофосфатазы.
3.3. Влияние фитогормонов на активность УАТФазы и Уипрофосфатазы
3.4. Протонные насосы тонопласта во время роста и развития растения.
Экспериментальнаи часть
1. Методы исследовании
1.1. Получение мембранной фракции, обогащенной фрагментами тонопласта из клеток колеоптилей кукурузы.
1.2. Определение КС1стимулнруемой пирорфосфатазной и
ЫОзингибнруемой АТФазной активности.
1.3. Определение НАДН и НАДФН цитохром срсдуктазной активности.
1.4. Определение АТФ и иирофосфатзависимого транспорта Н в везикулярных фракциях.
1.5. Определение количества белка по сорбции красителя метод Брэдфорд
1.6. Статистический анализ.
2. Результаты и обсуждение
2.1. О характере мембранных препаратов, использованных для анализа пирофосфатазной и АТФазной активности
2.2. Свойства пирофосфатазной активности фракции внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы
2.3. Свойства АТФазной активности фракции внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы
2.4. АТФ и пирофосфатзависимый транспорт Н в везикулярных фракциях, обогащенных тонопластом, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы.
2.5. Влияние ингибиторов на уровень АТФ и пирофосфатзависимого транспорта Н.
2.6. Влияние Са2 на Ыингибирусмую АТФазпую и пирофосфатазную активность.
2.7. Влияние Са2 на уровень АТФ и пирофосфатзависимого транспорта И
2.8. Влияние рутениевого красного на гидролитическую и Нтранспортирующую активность НАТФазы и Нпирофосфатазы Утипа в везикулах эндомембран из клеток колеоптилей кукурузы
2.9. Са2 7Нантипортср в везикулах внутриклеточных мембран, выделенных из клеток колеоптилей кукурузы
2 Гидролитическая и транспортирующая активность НАТФазы и ГСпирофосфатлзы Утипа на различных стадиях роста клеток проростков
кукурузы.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Существует представление о том, что действует как хаотропный агент, ингибирующий VАТФазу путем разрушения се субъединичной структуры. Однако концентрация нитрата, которая необходима для подавления активности IАТФазы, часто намного ниже концентрации, требуемой для диссоциации субъединиц М. Специфический ингибирующий эффект нитрата на VАТФазу, новидимому, обусловлен его прямым действием на активность Ы насоса, он обратим при низких концентрациях 1 мкМ, что может быть связано с окислением фупп М. Субъединицы периферического комплекса V, А и В содержат несколько консервативных остатков циетеина. Имеются экспериментальные данные, указывающие на то, что нитрат, действуя как окислительный агент, способен окислять с образованием днеульфидных связей группы цистеиновых остатков на А и В субъединицах и кДа субъединицы стебелька . В отличие от VАТФазы тонопласта, а и р субъединицы i комплекса в АТФазах митохондрий лишены подобных остатков циетеина М. V,комплекса . АТФзависимого транспорта Н4 дициклогексилкарбодиимид ДЦКД наиболее специфичен к АТФазам типа. Ингибитор АТФазы митохондрии азид лишь в незначительной степени подавляет активность VАТФазы v . В отличие от АГФаз, VАТФаза не чувствительна к олигомицину . Ванадат, ингибитор НАТФазы плазмалеммы и других АТФаз типа, также не оказывает влияние на НАТФазу тонопласта Н. В отличие от Vпирофосфатазы, которая ингибируегся ионами Са2, при низких концентрациях 2 VАТФаза не обнаруживает высокой чувствительности к ионам кальция i М. Фермент может активироваться ионофорами, увеличивающими проницаемость мембран. Показана активация VАТФазы, выделенной из корнеплодов красной свеклы, ионофорами гранмициднном Д и карбонилцианидтхлорфенилгидразоном СССР Черняева Е. Холодогт В. П.,. По данным Н. НАТФаза тонопласта растений прямо стимулируется ионами СГ, и эта активация сопряжена с транспортом СГ в вакуоль. В цитоплазме растительной клетки концентрация СГ составляет около мМ и прямая стимуляция ионами хлора VАТФазы может быть важна для регуляции градиента и формирования мембранного потенциала тонопласта 1. Существует представление о том, что хлоридион является эффекгором АТФазы вакуолярного типа у растений, чего не наблюдается у животных. В экспериментах на протсосомах со встроенной, частично очищенной VАТФазой было показано, что ионы СГ оказывают непосредственное влияние на гидролитическую и транспортную активность А1Фазы , Н. НАТФаза тонопласта отличается от НАГФаз других мембранных структур но субъединичной организации и иммунореактшшости Р. М., . Функциональные субъединицы VАТФаз обнаруживают сходство с АТФазами хлоропластов и сопрягающих мембран митохондрий v . Вакуолярная АТФ аза является мультисубъсдиничным комплексом кДа. Размеры и количество субъединиц фермента могут варьировать в зависимости от объекта исследования. С помощью метода экстракции дихлорэтаном и солюбилизации 2 тритоном Х0 с последующей гельфильтрацией, была очищена VАТФаза из листьев каланхоэ и корнеплодов красной свеклы, показана ее субъединичная организация М. ГА ГФаза состоит из двух функциональных комплексов периферического комплекса V кДа, локализованного на поверхности цитоплазматической стороны мембраны и отвечающего за гидролиз АТФ, и иптефалыюго комплекса V0 кДа, обеспечивающего перенос Н через мембрану. Каталитический комплекс V содержит от до различных субъединиц с молекулярными массами А кДа V1, В кДа V 2. С кДа V , кДа V 8v, Е кДа V4, кДа V7, кДа VV1, II кДа V. Возможны различия в составе и количестве неосновных субъединиц Vi и V комплексов. Каталитический комплекс образует гсксомер им в диаметре, представленный тремя копиями А и В субъединиц. Субъединица Л связывает нуклеотид и катализирует гидролиз АТФ. В субъединица имеет нуклеогидсвязывающий сайт, однако, она не является каталитической. Полагают, что фосфорелироваине субъединицы В может выполнять регуляторную роль при гидролизе субстрата, но механизм регуляции пока не ясен. Субъединицы С, , Е образуют стеблеподобную структуру нм в высоту, соединяющую V и V0 комплексы.