Секретируемые белки цианобактерии Synechocystis и использование их сигнальных пептидов для секреции гетерологичных белков

• Автор: Сергеенко, Татьяна Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы секреции белков и образования поверхностных

структур в клетках Грамотрицательных бактерий

1.1.1. Транслокация секретируемых белков через цитоплазматическую мембрану

1.1.1.1. Сигнальные последовательности секретируемых белков

1.1.1.2. Транслокация секретируемых белков

через ВнМ посредством Бессистемы

1.1.2. Путь шаперонапосрсдника

1.1.3. Механизм секреции I типа

1.1.4. Механизм секреции II типа

1.1.4.1. Секреция белков через внешнюю мембрану
1.1.4.2. Пили IV типа
1.1.5. Механизм секреции III типа
1.1.6. Механизм секреции IV типа
1.1.7. Механизм секреции V типа
1.2. Поверхностные структуры ЭупесНосузИз
1.3. Секрегорный аппарат ЭупесИосузШ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Штаммы Е. со
2.2. Штамм 5упесИосуз
2.3. Плазмиды и векторы
2.4. Условия культивирования ЗупесИосуягз
2.5. Выделение секретируемых белков Яупесюсуяз
2.6. Фракционирование белков
2.7. Перенос белков на мембрану
2.8. Определение аминоконцсвых последовательностей
2.9. Анализ секвенированных последовательностей
2 Экспериментальные стрессовые условия культивирования i
2 Выделение РНК и нозернблог анализ
2 Анализ экспрессии генов с помощью ДКмикроэррей
2 Синтетические олигонуклеотиды соответствующие лидерным пептидам
секрстируемых белков
2 Секвенирование плазмид
2 Трансформация клеток i
2 Выделение геномной ДНК i
2 Амплификация фрашенгов ДНК
2 Функциональный тест на активноегь лихеназы в клетках . i
2 Функциональные тесты на активность лихеназы, секрегируемой
в среду культивирования клетками . i
2 Функциональный тест в ПААГ на активность лихеназы,
секрегируемой в среду культивирования клетками . i
2 Функциональный тест на активность лихеназы в клетках i
2 Функциональный тест на активность лихеназы, секрегируемой
в среду культивирования клетками i
2 Функциональный тест в ПААГ на активность лихеназы,
сскрстируемой в среду культивирования клетками i
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация и предполагаемые функциональные характеристики
секретируемых белков i
3.2. Влияние различных стрессовых факторов на секрецию
белков клетками i
3.2.1. Влияние различных стрессовых факторов на экспрессию
генов, кодирующих секретируемыс белки i
3.2.2. Динамика транскрипции гена i пол воздействием
различных стрессовых факторов
3.2.3. Влияние стрессовых факторов на экспрессию генов, кодирующих
предполагаемые компоненты механизма секреции i
3.3. Лидерные последовательности РИА и его гомологов
3.4. Конструирование рекомбинантных штаммов i и анализ секреции репортерного белка с синтезированными
лидерными последовательностями
3.4.1. Клонирование лидерных последовательностей
3.4.2. Конструирование плазмид, содержащих реиортерный ген i
в трансляционной рамке с лидерными последовательностями
3.4.3. Конструирование плазмид, содержащих Не В и лидерные последовательности для трансформации клеток i
3.4.4. Проверка экспрессии гена ИсВ в клегках . i
3.4.5. Проверка секреции лихеназы в среду культивирования
клетками . i
3.4.6. Проверка секреции лихеназы в среду культивирования клетками . i
с помощью ельэлектрофореза секрегируемых белков
3.4.7. Конструирование рекомбинантных штаммов i
3.4.8. Проверка экспрессии гена ИсВ в клетках i
3.4.9. ровсрка секреции лихеназы в среду культивирования трансформантами i
ЗАКЛЮЧЕНИИ
ВЫВОДЫ
С1ШСОК ИС1ЮЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ар ампициллин
ак аминокислоты
Кш канамицин
8Э8 додецил сульфата натрия
ТЕМЮ ЫЛЛЫтетраметилэтилендиамин
ЬВМ белок внешней мембраны
БВнМ белок внутренней мембраны
вм внешняя мембрана
ВнМ внутренняя мембрана
кДа килодальтон
ПААГ полиакриламидный гель
ОСИ основной путь секреции
ВВЕДЕНИЕ


Идентифицировать белки, секретируемые цианобакгерией ЗупесИосузИз в среду культивирования. Определить нуклеотидные и аминокислотные последовательности лидерных пептидов, отвечающих за секрецию. Сконструировать рекомбинантные штаммы цианобактерии 5упесИосуз и провести анализ секреции репортерного белка с лидерными послсдовательноегями секретируемых белков цианобакгерии ЗупесИосуяНз. Внеклеточная среда А. Рисунок 1. Секреторного пути в клетках Грамположительных и 1рамотрицатсльных бактерий Рцеу, . Отличительной особенностью Грамотрицательных бактерий является необходимость переноса секретируемых белков как через цитоплазматическую мембрану, так и через внешнюю мембрану. Секретируемыми являются белки, высвобождаемые во внеклеточное простанство, а также белки, которые после транслокации по ОСП остаются на клеточной поверхности или же образуют комплексы с компонентами клеточной поверхности. Секреция белков включает в себя этапы, показанные серыми и черными стрелками. Движение экспортируемых белков нецитоплазматических, но не внеклеточных показано серыми стрелками. ГЛАВА 1. Механизмы секреции белков и образования поверхностных структур в клетках Грамотри нательных бактерий. Механизмы секреции белков Грамотрицательными бактериями можно разделить на шесть групп табл. Три механизма представляют собой двустадийный процесс, первым этапом которого является перенос белков из цитоплазмы в периплазму посредством 8ессистемы от английского Гог яссгебоп, когда белки транслоцируются через ВнМ с отщеплением Ыконцевой сигнальной последовательности Тгаш е1 а. Есопошои, , вторым экспорт процессированных белков через ВМ. Остальные пути являются 8еснезависимыми и обеспечивают секрецию полипептидов из цитоплазмы непосредственно в межклеточное пространство. Таблица 1. Бактериальные системы секреции белков и структуры клеточной поверхности. Классификация типов секреции по работам , . Тип III Нет белки ii . Механизмы секреции белков Грамотрицательными бактериями можно разделить на шесть групп. Структурные субъединицы органелл на поверхности бактериальной клетки являются секретируемыми белками, т. I, II, IV и III типов является необходимым условием для биосинтеза 8слоя, пилей и жгутиков соответственно см. Отдельный механизм секреции с участием шаперонаносредника используется для формирования пилей I типа. Сигнальные последовательности секретируемых белков. Бактериальные клетки секретируют сотни различных белков, отличающихся по свойствам, функциям, и месту конечного назначения. Информация, позволяющая клетке различать, например, цитоплазматические и секретируемыс белки заложена в положительно заряженных концевых последовательностях этих белков, состоящих обычно из аминокислот ак, содержащих как минимум гидрофобных ак, и называемых лидерными или сигнальными пептидами , . Сигнальные пептиды состоят из трех доменов положительно заряженного конца домена, неполярной гидрофобной центральной части I Iдомена и полярного, процессируемого Сконца Сдомена рис. V Ii, . Аминокислотные последовательности доменов не являются строго консервативными, индивидуальны для каждого вида секретируемых белков, но отличаются общими физикохимическими свойствами I , . Положительный заряд конца сигнального петида, обусловленный наличием лизина и аргинина, увеличивает скорость процессирования и транслокации пребелка, но не определяет эти процессы. Прсбслки с нейтральным или отрицательно заряженным сигнальным пептидом также будут процсссированы, но с меньшей скоростью i, . Предполагается, что положительно заряженный домсн связывается с отрицательно заряженной поверхностью липидного бислоя ВнМ Vi , . Снижение концевого положительного заряда приводит к уменьшению степени взаимодейстия прсбелокмембрана, что, однако, может быть компенсировано усилением гидрофобности I Iдомена. Таким образом, взаимодействие сигнальной последовательности с ВнМ является важным этапом при транслокации пребелка, а положительный заряд конца, возможно, определяет необходимую ориентацию сигнальной последовательности секретируемого белка в липидном бислое.