Структурно-функциональная характеристика формирования клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы

• Автор: Сальников, Вадим Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 272 с. : ил.

Введение.

. Обзор литературы.

1. Состав и структура клеточной стенки.

2. Биосинтез компонентов клеточной стенки.

3. Биосинтез целлюлозы.

3.1. Субстраты биосинтеза целлюлозы и пути их образования.

3.2. Каталитический центр. Терминальные комплексы,

розетки. .

3.3.Ориентация микрофибрилл. Участие цитоскелета в

формировании клеточной стенки растений.

4. Первичная и вторичная клеточная стенка.

5. Использование методов микроскопии для изучения клеточной
стенки растений.
II. Объекты и методы.
1. Общая характеристика объектов исследования.
М.Флоэмные волокна стебля льнадолгунца
i iii .
1.2. Волоски семян хлопчатника i i
1.3. Культура клеток циннии ii .,
формирующая трахеальные элементы.
2. Подготовка растительного материала.
3. Флуоресцентная микроскопия.
3.1. Подготовка срезов стебля льнадолгунца.
3.2.Подготовка клеток циннии.
4. Сканирующая электронная микроскопия.
5. Трансмиссионная электронная микроскопия
метод ультратонких срезов.
6. Цитохимический анализ.
7. Иммуноцитохимическнй анализ.
7.1. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителом к Р1 галактанам на ультратонких срезах стебля льна.
7.2. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителами к сахарозосинтазе, актину и каллозе на ультратонких срезах волосков семян хлопчатника и трахеальных элементах циннии.
8. Статистическая обработка результатов.
8.1. Количественная оценка иммуноэлектронномикроскопической метки на срезах флоэмных волокон льнадолгунца.
8.2. Количественная оценка иммуноэлектронномикроскопической метки на срезах волосков семян хлопчатника.
8.3. Количественная оценка иммуноэлекрономикроскопической метки на срезах трахеальных элементов циннии.
III. Результаты и обсуждение.
I. Волокна склеренхимы флоэмные волокна льнадолгунца.
1.1. Флюоресцентная микроскопия.
1.1.1. Характеристика и использование точки слома
ТС для планирования и проведения экспериментов.
1.1.2. Окрашивание срезов СеНиЯиог СФ.
1.1.3. Окрашивание срезов специфическим красителем на пектиновые вещества СКП.
1.1.4. Динамика формирования флоэмных волокон.
1.1.5. Аутофлуоресценция лигнина во флоэмных волокнах и сосудах ксилемы в стебле льнадолгунца.
1.1.6. Механическое разделение пучков флоэмных волокон луба и слоя клеток вторичной ксилемы древесины.
1.2. Изучение строения флоэмных волокон и структуры клеточной стенки методом сканирующей электронной микроскопии СЭМ.
1.2.1. Расслоение стебля льнадолгунца на последних стадиях созревания.
1.2.2. Поверхность флоэмных волокон.
Закрученность волокон.
1.3. Изучение флоэмных волокон в ходе онтогенеза растений льнадолгунца методами трансмиссионной электронной микроскопии.
1.3.1. Ультраструктура флоэмных волокон.
1.3.2. Цитохимический анализ флоэмных волокон. Результаты окрашивания срезов по методу Тьери. Двуслойность клеточной стенки волокон.
1.3.3. Иммуноцитохимический анализ распределения галактана в тканях стебля льнадолгунца.
1.3.4. Определение локализации лигнина во флоэмных волокон и вторичной ксилемы методом цитохимиичсского анализа ферментзолото .
2. Трихомы волоски семян хлопчатника.
2.1. Ультраструктура волосков семян хлопчатника.
2.2. Иммуноцитохимическая локализация клеточных структур, белков и полисахаридов, участвующих в формировании клеточной стенки и входящих в ее состав.
2.2.1. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы.
2.2.2. Иммуноцитохимическая локализация каллозы.
2.2.3. Двойное иммуномечение ультратонких срезов сахарозосинтаза каллоза.
2.2.4. Иммуноцитохимическая локализация актина.
2.2.5. Двойное иммуномечение ультратонких срезов сахарозосинтаза актин.
3. Трахеальные элементы культивируемые клетки циннии Хтта ееапз Ь
3.1. Ультраструктура трахеальных элементов циннии.
3.2. Иммунофлуорусцентная микроскопия.
3.3. Электронномикроскопическая иммунолокализация
клеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки трахеальных элементов циннии.
3.4. Анализ взаиморасположения структур с использованием иммуноцитохимических реакций на ультратонких серийных срезах.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Начальный этап гликозилирования происходит в полости эндоплазматического ретикулума и включает котрансляционный перенос олигосахаридной цепочки Ыацетилглюкозамин2. После удаления трех терминальных остатков глюкозы гликоиротсид транспортируется в аппарат Гольджи, где различные гликозидазы и гликозилтраисферазы формируют углеводную часть молекулы . Одним из характерных отличий растительных гликопротеидов от их аналогов в клетках животных является отсутствие сиаловой кислоты и наличие остатка ксилозы, соединенного ,i с маннозой. Фенольные соединения клеточной стенки синтезируются в многоступенчатом процессе из фенилаланина, производными которого являются многие другие вторичные соединения клетки Запрометов, , , , , . Хотя разнообразие природных фенольных соединений чрезвычайно велико и исчисляется многими тысячами, их роднит не только строение, но и биогенетическая природа. Подавляющее большинство фенольных соединений образуется с использованием в качестве ключевого
предшественника шикимовой кислоты Запрметов, . Основными ферментами, участвующими в образовании фенольных соединений клеточной стенки являются . Р0 зависимая монооксидаза, КоА лигаза кумаровой кислоты и дегидрогеназа коричного спирта. Фенольные предшественники полимеризуются в лигнин посредством окислительного механизма, через соединение свободных радикалов промежуточных соединений. Суть процесса заключается в том, что с помощью специальных ферментов пероксидаз или лакказ из монолигнолов образуются свободные радикалы, которые затем неферментативным путем объединяются в полимер. До сих пор не окончательно решен вопрос о том, какая из оксидаз принимает участие в образовании свободных радикалов. Разница между лакказой и псроксидазой заключается в том, что одна из них используется в качестве акцептора электронов кислорода, а другая перекись водорода. Механизм транспорта монолигнолов к клеточной стенке и регулирующие его факторы остаются не до конца выясненными. Существует предположение, что перенос монолигнолов за пределы плазмалеммы осуществляем я с помощью пузырьков аппарата Гольджи . Биосинетз целлюлозы. Субстраты биосинтеза целлюлозы и пути их образования. Донорами гликозильных остатков для различных полигликанов являются различные нуклеозиддифосфаты сахаров НДФС для крахмала АДФГ аденозиндифосфатглюкоза, для гликогена УДФГ уридиндифосфатглюкоза Тарчевскнй, Марченко, . Существовало мнение, что в волосках семян хлопчатника целлюлоза синтезируется только из ГДФГ гуанозиндифосфатглюкоза Хасид, , . Также было показано, что в роли гликозильных остатков для целлюлозы выступает УДФГ Степаненко, Морозова, , , i, . В работах , i , . ГДФГ, а использование в качестве субстрата синтеза целлюлозы УДФГ было незначительным. Переход к образованию целлюлозы высокой степени полимеризации для формирования вторичной клеточной стенки сопровождается сменой основного донора гликозильных радикалов включение глюкозы в целлюлозу из ГДФГ резко уменьшается, и в роли основного субстрата начинает выступать УДФГ. Используя развивающиеся волокна хлопчатника, культивируемые i vi, i, проследили путь углерода из экзогенной глюкозы в целлюлозу. Результаты таких кинетических исследований, совместно с компьютерным моделированием, также свидетельствовали но не доказывали, что УДФГ является промежуточным соединением на пути к целлюлозе. Выводы этих авторов получили подтверждение в работах Казанского института биологии КФАН СССР иод руководством Тарчевского И. А. Тарчевский и др. В нефотосинтезирующих тканях растений основным исходным субстратом синтеза структурных полисахаридов является главный транспортный продукт фотосинтеза сахароза. Притекающая из фотосинтезирующих органов сахароза может превращаться в клетках в глюкозу и фруктозу с помощью инвертазы, локализованной в плазмалемме. Глюкоза фосфорилирустся, затем глюкозный остаток переходит в УДФГ и принимает участие в синтезе структурных полисахаридов. Образование УДФГ катализирует УДФглюкозопирофосфорилаза в обратимой реакции глюкозо1Ф УТФ УДФГ ФФ, i, .