Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при сомаклональной изменчивости у кукурузы

• Автор: Осипова, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. Обзор литературы

1.1 Сомаклональная изменчивость.

1.1.1. ричины сомаклональной изменчивости

1.1.2. Факторы, влияющие на сомаююнальную изменчивость.

1.1.3. Возможные механизмы сомаклональной изменчивости.

1.1.4. Изменения, возникающие в процессе

сомаклональной изменчивости.

1.1.5. Практическое использование сомаклональной изменчивости

1.2. Молекулярпые маркеры, применяемые для изучения

сомаклопальной изменчивости.
1.2.1. Белковые маркеры
1.2.2. ЛЕЕРмаркеры
1.2.3. РСЯмарксры.
1.2.3.1. МАЛРмарксры
1.2.3.1.1. МАЛРмаркеры с праймерами произвольной последовательности
1.2.3.1.2. МЛАРмаркеры с праймером, комплементарным
микросателлитному повтору.
1.2.3.2. БТБмаркеры.
1.2.3.2.1. БТБмаркеры, основанные на полиморфизме микросатсллитов.
1.2.3.2.2. БТБмаркеры, созданные на основе МААР.
1.2.3.2.3. ЯТБмаркеры, основанные на выявлении толковых мутаций
при введении нуклеотидных замен в праймеры
1.2.3.3. ЯЕМАРмаркеры.
1.2.3.4. Маркеры, сочетающие рестрикцию, гибридизацию и РСЖметоды
1.2.3.4.1. Использование в качестве мишени III Рпродукта.
1.2.3.4.2. Использование рестрицированной геномной ДНК
в качестве основы для ПЦР.
1.2.3.4.3. ПБИ зонды могут быть получены спомощью ПЦР
1.2.3.5. Комплексный подход к анализу сомаклональной изменчивости
с помощью молекулярных маркеров.
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Исходный материал
2.2 Выделение ДНК для РСЯанализа
2.3. Амплификация ДНК.
2.4. Проведение электрофореза в агарозном геле
2.5. Качественная и количественная оценка полиморфизма
2.6. Выделение фрагмента из геля
2.7. Клонирование фрагмента.
2.8 Выделение плазмиды.
2.9. Секвенирование.
2 одбор ВСАЯпраймеров и амплификация с ними.
2 Синтез праймеров.
2 Выделение ДНК для блоттгибридизации по Саузерну.
2 Блотгибридизация по Саузерну
2 Анализ последовательностей специфических БСАЯфрагментов.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Характеристика сомаклонов
3.2. ЯАРОанализ первая серия опытов.
3.3. Воспроизводимость ЯАРО и БЯспектров.
3.4. КАРП и БЯанализ вторая серия опытов
3.5. Количественная оценка ЯАРО и 1БВЯполиморфизма
3.6 БСАЯанализ
3.7. Наследование БСАЯмаркеров.
3 8 Анализ нуклеотидных последовательностей ВСАЯмаркеров
3.9. Блотгибридизация
3 Секвенирование участка гена
анодной пероксидазы кукурузы 2тАр1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Культивирование клеток на искусственных питательных средах, содержащих, как правило, экзогенные фитогормоны, значительно нарушает гормональный баланс, вследствие чего могут возникнуть морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций. Показано, например, что 2,4Д и ПУК стимулируют эндополиплоидию, политению и амитозы ii , Долежел и Новак, , 2,4Д в ряде случаев вызывает мейзоподобные процессы ii . Шамина, кинстин и БАП дополнительную репликацию ДНК и мутации Оопо, Кунах, . Вместе с тем получены данные о том, что повышенная концентрация кинетина 1 мгл по сравнению с 0. Кунах и Зосимович, Кунах и сотр. Другие исследователи также показали, что гормональный состав среды существенно не влияет на хромосомный набор клеток ii , . Более того, установили, что при инициировании каллусообразован и я на сегментах листа и стебля взрослого растения Н ii на среде без гормонов частота диплоидных митозов была почти вдвое ниже, а тетраплоидных выше, чем на среде с ауксином и цитокинином. Частота каллусообразован и я на безгормональной среде была ниже, более низким был и темп роста каллуса Кунах и Алпатова, . Повидимому, равма поранение, вычленение из организма и влияние компонентов среды но без гормонов могут индуцировать дедифференциацию и пролиферацию далеко не всех и к тому же в значительной мере не диплоидных клеток исходного экспланта. Гормоны же в оптимальных дозах и соотношении в комплексе с другими факгорами каллусообразования стимулируют эти процессы значительно эффективнее и прежде всего, вероятно, в диплоидных клетках, в ряде случаев не вызывая на первых этапах какихлибо заметных перестроек генома. Такие перестройки могут появляться в дальнейшем через несколько суток после начала пролиферации. Это свойственно, вопервых, не всем видам растений и, вовторых, прежде всего тем эксплантам, клетки которых являются изначально диплоидными, как это было показано, например, на чесноке Долежел и Новак, . Изложенные данные позволяют сегодня говорить не только о существенном влиянии условий культивирования на уровень и спектр геномной изменчивости i vi. Они свидетельствуют о возможности использования факторов среды и условий роста в качестве регуляторов изменчивости клеток как при индукции каллусообразования, так и, особенно, при длительном пассировании клеточных культур, что было продемонстрировано во многих экспериментах Кунах и Зосимович, Павлова и сотр. Кунах и Алпатова, Кунах и Захленюк, i . Захленюк и Алексеева, Захленюк и Кунах, Кунах и сотр. С целью сохранения кариотинической стабильности в суспензионных культурах, как правило, их регулярно пассируют и или применяют специально спланированные питательные среды v , . Для культуры протопластов также были предложены среды, которые обеспечивают генетическую стабильность на этапе культивирования протопластов, клеток и регенерации растений i i, . Для понижения числа хромосом у культивируемых растительных клеток и получения гииоднплоидов используют аналог аминокислоты пфторфеии л аланин ФФА , или гербицид изопропил 3хлорфенилкарбамат i. Подобный эффект, а также генетическую стабильность клеточных популяций могут вызывать синтетические вещества цитокининового действия v . Некоторые аналоги цитокининов, в частности тнацил, с успехом используются для сохранения и поддержания диплоидного состояния в культуре клеток растений Кунах и Захленюк, . Продолжительность культивирования. Длительное пассирование i vi способствует повышению генетического разнообразия как среди культивируемых клеток, так и среди полученных из них растений, часто сопровождается изменением уровня плоидности обычно в сторону его повышения, накоплением анеуплоидных клеток, хромосомными аберрациями i, i, . Различия между клетками по числу и строению хромосом отражаю гея в других их особенностях скорости роста, устойчивости к неблагоприятным факторам и тогда клетки вступают в конкурентные взаимоотношения.