Везикулярный транспорт PIP-аквапоринов в растительной клетке при осмотическом стрессе

• Автор: Шевырева, Таисия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Введение.

Цель и задачи работы

1. Обзор литературы

1.1. Регуляция аквапоринопосрсдованной водной проницаемости плазмалеммы растительной клетке

1.2. Везикулярный транспорт в эукариотической клетке

1.3. Белки, формирующие систему везикулярного транспорта

1.4. Эндоцитоз в эукариотической клетке

1.5. Особенности методологии исследования везикулярного транспорта в растительной клетке

1.6. Эндосомальный компартмент у растений.

1.7. Роль рециркуляции белков плазмалеммы в регулировании ее транспортной функции

2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования
2.2. Регистрация кинетики изменений объема протопластов
2.3. Оценка акт ивности везикулярного транспорта в протопластах по измерению интенсивности флуоресценции 1.
2.4. Исследовагис везикулярноготранспорта методом флуоресцентной микроскопии.V .7.
2.5. Непрямая иммунофлуоресцеитная микроскопия Iаквапориюв в клетках и протопластах
2.6. Получение препаратов мембран.
2.7. Определение содержания белка в препаратах мембран.
2.8. Денатурирующий электрофорез мембранных белков в ПА Агеле.
2.9. Всстернблот анализ РРаквапоринов.
2 Голубой нативный электрофорез
3. Результаты.
3.1. Изменение объема протопластов при осмотическом стрессе
3.2 Активность везикулярного транспорта в условиях осмотического
стресса.
3.3. Распределение аквапоринов Р1Ртипа в клетках суспензионной культуры мезофилла сахарной свеклы и изолированных из них протопластах при осмотическом стрессе
3.4. Распределение Р1Раквапорннов в мембранных фракциях различной плотности.
3.5. Устойчивость мембранных структур плазмалеммы, содержащих аквапорины Р1Ртнпа, по отношению к различным детергентам.
3.6. Локализация стеринобогащенных доменов плазмалеммы.
3.6.1. Конститутивный трафик стериисодержащих структур плазмалеммы
3.6.2. Влияние брефелдина А на мембранный трафик в протопластах мезофилла сахарной свеклы.
3.6.3. Осмотически индуцируемый трафик стеринобогащенных участков плазмалеммы.
4. Обсуждения
4.1. Механизмы осмотически индуцируемых изменений объема протопластов растительных клеток
4.2. Распределение аквапоринов Р1Ртипа в клетках и протопластах культуры мезофилла сахарной свеклы в различных осмотических условиях
4.3. Изучение аквапоринсодержащих доменов плазматической
мембраны
4.4. Исследование трафика стеринсодержащих доменов плазматической мембраны
Заключение
Выводы
Список литературы


На активность аквапоринов могут влиять различные факторы среды значение ix . Поскольку, известно, что в мембране аквапорины образуют тетрамеры, в которых каждый мономер функционирует как отдельный канал i . Подавляющее большинство1работ, посвященных исследованиям регуляции активности аквапоринов, сфокусировано на изучении их пострансляционных модификаций. В настоящее время показано, что аквапорины способны метилироваться, фосфорилироваться и гликозилироваться по определенным сайтам , . Однако, как было показано совсем недавно, значение пострансляционных модификаций не ограничивается изменением активности аквапоринов. Они могут играть существенную роль в регуляции стабильности этих молекул и их взаимодействии с другими соединениями, в том числе и с белками i . Так, например, в работе v i с соавторами было показано, что фосфолирйрование I по 6 2 отражается на активности этих белков, в то время как фосфолирпрованис по 5 не влияет на нее. Кроме того, с соавторами показали, что трафик Р1Раквапоринов
внутри клетки зависит от их фософолирированного состояния по . Везикулярный транспорт аквапоринов может приводить к изменению их содержания в мембране, что также может отражаться на ее водной проницаемости. Наряду с активизацией внутриклеточного трафика этих белков их количество может регулироваться и на других уровнях организации живых систем. Например, для 1 мембраны эритроцитов было продемонстрировано ингибирование его убиквнтинзависшюй деградации, что приводило к увеличению времени жизни этого белка в мембране i . Нет никаких оснований считать, что подобный механизм регуляции содержания мембранных белков, в том числе и аквапоринов, не может иметь место у растений, но и экспериментальных данных подтверждающих возможность такого способа регулирования времени жизни растительных аквапоринов пока нет. В настоящеевремяизвестно достаточно много об изменении активности транскрипции генов аквапоринов в зависимости от различных факторов окружающей среды, таких как пониженная температура, засуха, засоление, свет, а также от концентрации в среде АБК, ГАз и тяжелых металлов. Однако только в единичных работах например, i . Болес того, в работе V с соавторами было обнаружено, что экспрессия I увеличивалась только в течение первого часа гиперосмотического воздействия, в то время как количество соответствующего белка увеличивалось втечение всех часов эксперимента. Таким образом, внугриклеточный график аквапоринов может играть ключевую роль в поддержании и изменении количества этих белков в мембране, участвуя при этом в регуляции осмотической водной проницаемости мембран. Вместе с тем они подробно исследованы в клетках животных и дрожжей. Между тем, показано, что на молекулярном уровне эти процессы являются консервативными и в общих чертах схожи как в клетках растений, так и животных i, . Система везикулярного гранспорта в эукариотических клетках представляет собой сложно устроенный и скоординированный механизм, который необходим для нормального функционирования клетки. Впервые гипотеза о везикулярном транспорте как необходимом событии для поддержания структуриофуикцпоналыюй организации клетки была предложена с коллегами в г. Нобелевскую премию. Суть этой теории заключается и том, что транспорт необходимых для функционирования клетки молекул, главным образом белков, между клеточными компартментами осуществляется за счет трафика мембранных везикул, в которые эти молекулы заключены , . Везикулы формируются из донорной мембраны в ходе процесса, получившего название отпочкбвыванйе i рис. Транспортируемые белки в зависимости от того, являются ли они интегральными мембранными или растворимыми белками, могут либо входить в состав мембраны, формирующей везикулу, либо находиться непосредственно в люмене везикулы. Процесс включения белков в везикулу i i носит далеко не случайный характер и определяется в основном наличием специальных аминокислотных сортингпоследовательноетей в белках. Отделившаяся от донорной мембраны везикула направляется в сторону акцепторной мембраны за счет работы губулниового цитоскелета у животных ii, .