Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата : катализ и изменение его природы сайт-направленным мутагенезом

• Автор: Топоркова, Яна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 172 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метаболизм оксилипинов

1.2. Общая характеристика цитохромов Р

1.3. Общая характеристика ферментов семейства

цитохромов Р0.

1.3Л. Субстратная специфичность ферментов семейства СУР

1.3.2. Распространение и внутриклеточная локализация

1.4. Аллсноксидсинтаза.

1.5. Общая характеристика 3.

1.5.1. 1Гредполагаемое функциональное значение 3.

1.6. Физиологическое значение продуктов реакций,
катализируемых ферментами .
1.7. Независимые исследования взаимосвязи структуры и функций
ферментов .
1.8. Ферменты семейства вне царства растений.
1.9. Постановка цели исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы и векторы
2.1.1. Характеристика штаммов.
2.1.2. Характеристика вектора рЕТ.
2.1.3. Хранение штаммов . i и рекомбинантных плазмид
2.2. Питательные среды.
2.3. Приготовление компетентных клеток . i.
2.4. Трансформация компетентных клеток . i.
2.5. Индукция синтеза рекомбинантных белков
2.6. Выделение и очистка рекомбинантного белка.
2.7. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.
2.8. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле
2 Амплификация фрагментов целевых генов с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР
2 Сайтнаправленный мутагенез.
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2 Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов.
2 Получение гидроперекисей жирных кислот
2 Инкубация рекомбинантного фермента
с 9гидроперекисью линолевой кислоты
2 Получение алленоксидсинтаз из семян кукурузы и льна.
2 Микропрепара гивные инкубации.
2 Анализ энантиомерного состава продуктов реакций, катализируемых
2 Инкубации ферментов 3 и дикого типа
и их мутантных форм с гидроперекисями жирных кислот.
2 Анализ продуктов реакций, катализируемых , методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ
. Хроматография на обращенной фазе
. Хроматография на нормальной фазе
. Анализ энантиомеров с помощью хроматографии
на хиральной фазе
2 Спектральные исследования.
2 Методы биоинформатики анализа структуры .
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клонирование и экспрессия рекомбинантного гена
3.2. Получение очищенного рекомбинантного фермента 3.
3.3. Продукты превращения 9гидроперекиси
линолевой кислоты под действием
3.4. Анализ энантиомерного состава
iI1фитоеиовой кислоты
3.5. Анализ энантиомерного состава акетола
и мстоксикетона.
3.6. Превращение гидроперекиси линолевой кислоты
под действием
3.7. Метанол из окисей аллена, синтезированных в результате инкубации гидроперекисей с 3 и
кукурузы
3.8. Образование окиси аллена под действием
АОС кукурузы и ее дальнейшее превращение после добавления 3 i iПО
3.9. Предположительная схема механизма реакции,
катализируемой 3.
3 Исследование взаимосвязи между структурой и функцией ферментов методом сайтнаиравленного мутагенеза.
3 Определение положения 1 в первичной последовательности .
3 Выбор сайтов для мутирования в 3.
3 Анализ продуктов 3 дикого типа и ее мутантных форм
3 Выбор сайтов для мутагенеза в первичной последовательности и сравнительный анализ результатов
сайтнаиравленного мутагенеза 3 и
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства , фермент подсемейства 3, является мультифункциональным. Первичный продукт 3 окись аллена после высвобождения из активного центра вновь захватывается ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно гидролиз и циклизацию с образованием 9акетола и рацемической гисЮоксофитоеновой кислоты, соответственно. Результаты экспериментов по сайтнаправленному мутагенезу свидетельствуют о принципиальной роли центрального домена 1спирали и триады в формировании определенного типа катализа ферментов семейства . Все ферменты относятся к близкородственной филогенетической г руппе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Апробация работы. IV Российском симпозиуме Белки и пептиды Казань, , а также на итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН . Работа является призером Международной школыконференции Генетика микроорганизмов и биотехнология МоскваПущино, . По результатам работы опубликовано две статьи в зарубежных рецензируемых изданиях. ГЛАВА 1. Многие мембранные липиды особенно фосфолипиды имеют сравнительно небольшое время жизни и могут высвобождать входящие в их состав жирные кислоты в ходе реакций, катализируемых липазами фосфол и пазами А, которые активируются некоторыми фитогормонами, а также биогенными и абиогенными стрессорами. Высвобождение схлинолеиовая кислоты из мембранных липидов под действием липаз может запускаться локальными или системными сигналами, такими как олигогалактурониды, хитозан, системин , , . V . V . Линолевая и алиноленовая кислоты дают начало липоксигеназной, или октадсканоидной, сигнальной системе, которая шрает ключевую роль в процессах развития и формировании ответа на стрессовые факторы , i, i, , , . В настоящее время имеется достаточно информации, чтобы считать липоксигеназный путь самостоятельной сигнальной системой Тарчевский, . Первую реакцию в липоксигеназном каскаде Рис. ЛОГ, ЕС 1. Хпентадиенового радикала линолевой или алиноленовой кислот в положении либо 9, либо Vi . Гидроперекиси, продуцируемые липоксигеназами, являются реактивными молекулами и могут наносить серьезный вред биологической системе, вследствие этого они должны подвергаться дальнейшим превращениям . Рис. Метаболизм полиненасыщенных жирных кислот в растениях. ЛОГ лигюксигеназа, АОС алленоксидсинтаза, ДЭС дивинилэфирсинтаза, ГПЛ гидропероксидлиаза, АОЦ алленоксидциклаза, ГПОД Г гидропероксилиноленовая кислота, КОДЛГ кетолиноленовая кислота, , , . Продукты первичной липоксигеназной реакции превращаются в различные соединения оксилипины в результате реакций, катализируемых различными ферментами, а именно липоксигеназами, гидропероксидредуктазами, эиоксиалкогольсинтазами, пероксигсназами, дивинилзфирсинтазами, гидропероксидлиазами или алленоксидсин газами Vi, i, , . Оксилипины, образуемые в липоксигеназном пути, включают гидрокси, эпокси и дивиниловые эфиры, летучие альдегиды и спирты, жасмоновую, травматиновую и фитодиеновую кислоты, травматин и др. Большинство работ, выполненных до настоящего времени, посвящено ЛОГ пути, продуктами которого являются жасмоновая кислота и ее производные. Большинство из них относится к физиологически активным соединениям, участвующим в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы и развитие цветков, корней МсСопп, , , , а также в формировании ответа на различные стрессовые факторы , , . О биологических функциях других членов семейства оксилипинов у растений известно меньше. Некоторые аспекты функционирования и биосинтеза этих ациклических или циклических соединений аналогичны таковым эйкозаноидного семейства липидных регуляторов у позвоночных I, , . Липоксигеназный путь растений сходен с таковым у животных. Оба пути ингибируются салициловой и ацетилсалициловой кислотами. У животных салициловая кислота ингибирует образование простагландинов, у растений жасмоновой кислоты . В растениях оксилипины образуются, в основном, из С i и С6 жирных кислот, тогда как у животных преимущественно из С .