Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus

• Автор: Киселева, Лариса Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Глицсролипиды и жирные кислоты цианобактерий

1.2. Адаптивные изменения жнрнокнелотного состава в клетках цианобактерий в зависимости от условий окружающей среды

1.3. Клонирование генов десатураз цианобактерий

1.4. Десатуразы жирных кислот цианобактерий функции, структу ра, биохимические свойства.

1.5. Температурозависимаи экспрессии генов десатураз цианобактерий

1.6. Физикохимические особенности ферментов термофильных организмов.

Глава II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Работа со штаммами цианобактерии

2.2. Конструирование геномной библиотеки.
2.3. Клонирование и секвсннрование ДНК.
2.4. Экспрессия езСгсна в клетках Е. соИ
2.5. Выделение РНК и нозернблот анализ
2.6. Получение антител против Д9десатуразы и вестернблопииг
2.7. Анализ липидов и жирных кислот
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Общая характеристика объекта
3.1.1. Ростовые характеристики Зупескососсия i
3.1.2. Липидный сосзав ЯупесИососсш, .
3.13. Жнрнокнслотный состав БупесИососсих V ис а пик.
3.2. Клонирование гена йеС из БупесИососст 4
. Особенности струкурь гена из термофильной
цианобактерии
3.4. Экспрессия рекомбинантной Л9десатуразы в . i.
3.5. Температурозависимая экспрессия гена Д9десатуразы термофильной цианобактерии v
3.5.1. Изменение уровня мРНК.
3.5.2. Изменение уровня белка
3.6. Влияние температуры на сосгав мембранных липидов v и
3.7. Температурозависимые изменения обшего содержания жирных кислот мембранных липидов
3.8. Температурозависимме изменения жирнокислотного состава в различных классах липидов
3.8.1. Температурозависимые изменения жирнокислотного состава нейтральных липидов v.
3.8.2. Температурозависимые изменения состава жирных кислот полярных липидов v
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Такой способ сохранения текучего состояния мембраны был обнаружен у бактерий, растений и животных i , , . Исходя из этого очевидно огромное значение знаний о структуре, свойствах и регуляции десатураз жирных кислот ферментов, отвечающих за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Задумыгая же нижеизложенную работу, нам было интересно узнать, а какие же механизмы лежат в основе адаптации к низкой температуре у термофильных организмов Насколько сходны механизмы температурной адаптации термофилов и мезофилов Вторым аспектом, представляющим не только академический, но и практический интерес, явилось приобретение знаний о структуре термофильных десатураз. Что лежит в основе термостабильности этих ферментов Насколько сильны изменения структуры генов, кодирующих дссатуразы в термофильных организмах Таким образом, наша работа должна была коснуться не только вопросов быстрой адаптации организмов к снижению температуры, но и вопросов эволюционной стратегии в приспособлении к жизни при экстремально высоких температурах. ЯупесИососсиз 4i. ЬупесИосухйь яр. IЭупесИососсиз ер. РСС и ЯупесИососаи яр. РСС обладают способностью включать в свой гоном чужеродную ДНК, что делает их важнейшими объектами для изучения принципиальных проблем генетической инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Важной для нас особенностью является то, что структура плазматической и тилакоидных мембран цианобактерий пз своему липидному составу сходна с таковой мембран хлоропластов высших растений. Таким образом, цианобактерии очень удобны как модельная система для изучения молекулярных механизмов адаптации к различного рода стрессам, в том числе и к снижению температуры окружающей среды. Целью нашей работы явилось клонирование генов десатураз из термофильной цианобактерии ЗупесИососсга уи1сапм, изучение их экспрессии в условиях снижения температуры окружающей среды. Клонировать ген ациллипидной десатуразы из ЗхпесИососсиь уикатм. ЗупесИососсш уыкапи. на уровне продуктов функциональной активности десахураз ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В связи с тем, что изучение адаптации растений к постоянно меняющимся температурным условиям ведтся достаточно давно и интенсивно, эта тема настолько широко представлена в научной литературе, что было бы трудно осветить все имеющиеся публикации в настоящем обзоре. Мы постарались изложить лишь тс вопросы, которые помогли бы понять смысл проделанной нами экспериментальной работы. Ряд вопросов целесообразно рассмотреть в исторической перспективе. Наблюдения за изменением состава различных мембран под действием низких температур позволили понять, что организмы способны адаптироваться к перепадам температур при помощи изменения степени насыщенности жирных кислот мембранных липидов. Понижение температуры выращивания вызывало накопление ненасыщенных жирных кислот. Далее изучение цианобактериальных мутантов, неспособных синтезировать полиненасышенныс жирные кислоты, привело к идентификации генов, кодирующих дгсатуразы жирных кислот, функция которых и заключалась в добавлении двойных связей в ацильные цепи. Клонирование генов десатураз растительного типа позволило изучать их экспрессию и делать некие предположения по поводу структуры ферментов. Иными словами, учные пытаются идентифицировать распознователей и передатчиков сигнала изменения температуры. Глицеролнниды и жирные кислоты цианобактерий. Цианобактерии содержат 4 основных класса глицеролипцдов МГДГ, ДГДГ, СХДГ и ФГ Рис. ГлДГ. ФЭ, фосфатидилсерин ФС и кардиолипин ii, , . МГДГ составляет около от всех глнцеролипидов, а ДГДГ, СХДГ и ФГ до . Каждый ГлДГ не превышает 1 i аЦ . Хлоропласты высших растений также содержат МГДГ, ДГДГ, СХДГ и ФГ в качестве основных компонентов, но в составе минорных имеют ФХ и ФИ , . ГлДГ встречается в цианобактериях, но не в эукариотических водорослях, и служит для первых предшественником в синтезе МГДГ , а. СГ9, С2Д9,, С 0, С