Трансформация растений осины (Populus tremula L. ) генами ugt и acb и излучение некоторых физиологических и биохимических параметров трансгенных растений

• Автор: Чепинога, Анастасия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 161 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Осина . как объект исследований

1.2. Клональное микроразмножение.

1.2.1. Этапы и факторы клонального микроразмножения

1.2.2. Индукция развития пазушных меристем.

1.2.3. Растения рода как объект для получения

культуры тканей..

1.3. Создание трансгенных растений.

1.3.1. Методы переноса генетического материала.

1.3.1.1. Трансформация растений на основе агробактериального вектора
1.3.1.2. Трансформация i
1.3.2. Трансформации растений рода .
1.4. Конъюгирование И УК
1.4.1. Гликозильные конъюгаты ИУК
1.4.1.1. УДФГтрансфераза из кукурузы и ген i, кодирующий
этот фермент
1.4.1.2. Трансформация растений геном
1.5. Гомеостаз ИУК.
1.5.1. Особенности инактивации ауксина в культуре клеток и
тканей растений
1.5.2. Гомеостаз ИУК на разных стадиях онтогенеза
1.6. Растения с измененным ауксинсвым гомеостазом
1.6.1. Мутантные растения арабидопсиса.
1.6.2. Трансформация растений генами бактериального пути
биосинтеза ИУК.
1.7. Белки, связывающие ацилКофермент А.
1.7.1. Растительные белки, связывающие ацилКоА
2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Объекты исследований.
3.1.1. Растительный материал
3.1.1.1. Стерилизация исходных эксплантов.
3.1.1.2. Условия клонального микроразмножения растений
3.1.1.3. Условия выращивания растений на фитотроне и в открытом грунте.
3.1.2. Бактериальные штаммы .
3.1.2.1. Условия культивирования бактериальных штаммов
3.1.2.2. Трехродительское скрещивание.
3.2. Трансформация растений.
3.2.1. Условные обозначения трансформированных растений.
3.3. Селекция трансформированных растений,
3.4. Выделение плазмидной ДНК.
3.5. Выделение растительной ДНК
3.6. Выделение тотальной РНК из растений
3.7. Полимеразная цепная реакция.
3.8. Саузерн блот гибридизация
3.8.1. Приготовление ДНКблотов по Саузерну.
3.8.2. Приготовление меченого зонда.
3.8.3. Гибридизация по Саузерну.
3.9. Гибридизация РНК
3Определение активности Рглюкуронидазы.
3 Количественное определение содержания ИУК.
3 Определение активности УДФГтрансферазы.
3 Статистическая обработка данных.
3 Использованные реактивы.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Получение трансконъюгантов и их анализ.
4.2. Получение трансформированных растений и отбор . трансформантов по активности маркерных ферментов
4.2.1. Введение в культуру i vi растений осины
4.2.1.1. Индукция корнеобразования у растений осины.
4.2.1.2. Влияние ИМК на корнеобразование осины
4.2.1.3. Индукция развития пазушных меристем
4.2.2. Устойчивость трансформированных растений
к селективному антибиотику
4.2.3. Изучение активности маркерного фермента рглюкуронидазы
в трансгенных растениях осины
4.3. Молекулярнобиологические доказательства трансформации.
4.3.1. Доказательства интеграции гена в геном растений осины
4.3.2. Доказательства интеграции и экспрессии гена
в трансгенных растениях осины.
4.4. Биохимические подтверждения состоявшейся трансформации
4.4.1. Активность УДФГтрансферазы в трансгенных растениях осины
4.4.2. Изучение влияния трансформации на содержание
свободной ИУК в трансгенных растениях
4.4.3. Влияние ИУК на рост трансгенных растений осины
4.5. Оценка физиологических параметров трансгенных растений .
4.5.1. Рост трансгенных растений осины i vi
4.5.2. Трансгенные растения в условиях фитотрона.
4.5.3. Рост трансгенных растений осины на полевой делянке
4.5.4. Фенологические наблюдения за трансгенными растениями,
произрастающими на полевой делянке.
5. ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Одним из способов создания лесных плантаций является организация короткоротационных энергетических плантаций быстрорастущих пород, дающих оборот древесины в 4 6летний период. В последнее время над этим работают ученые Канады, Швеции , i . Финляндии iv . В России исследования в этом направлении начаты в Астраханской Старова, Васютин, , Воронежской области Царев и др. Царев, Мироненко, и Башкирии Кулагин, Кагарманов, . В частности, российскими учеными изучаются продуктивность тополя в энергетических плантациях, сортовой состав, оптимальный оборот рубки по выходу фитомассы, густота посадки и др. Кулагин, Кагарманов, Царев, Мироненко, . Одним из широко используемых в качестве модельных объектов древесных растений являются виды рода тополь . Достаточно сказать, что первым древесным растением, выращенным из каллуса с использованием культуры тканей в году, был . ix. i, . Тополя широко используются при осушении топей . Бакулин, . Они хорошо переносят городские условия, поэтому давно завоевали признание у озеленителей Кулагин и др. При этом культивируются как природные виды, так и многочисленные межвидовые гибриды Культура тополей, Дутина, Бакулин, . Недостатком является присущее некоторым видам например, . . обильное развитие опушенных семян, разлетающихся при созревании женских сережек. Седых и др. При создании тополевых насаждений важными показателями являются приживаемость и характеристика роста тополей в конкретных лесорастительных условиях Кулагин, Кагарманов, . Древесина тополей крупнослойная, мягкая, хорошо поддается механической обработке, что обусловливает ее применение для изготовления различных столярных и токарных изделий, производства бумаги, фанеры, в спичечной и гидролизной промышленности. Особенно высоким спросом в промышленности пользуется осина Яблоков, . Осина хорошо возобновляется вегетативным способом, дает обильную пневую поросль, а корневые отпрыски на протяжении всей жизни дерева. Народнохозяйственное значение определяется выходом деловой древесины за относительно небольшой период выращивания. Емкое пшштие культура тканей растений включает все исследования с культурами растений в стерильных условиях, имеющие отношение к выращиванию протопластов растений, клеток, тканей, органов, зародышей и растенийрегенерантов Биотехнология растений. Оно включает более узкое понятие клональное микроразмножение использование техники i vi для быстрого получения неполовым способом растений, идентичных исходному Бутенко, . При этом растения, возникшие из меристемы, генетически идентичны родительским формам, в то время как растения, образовавшиеся из специализированных и каллусных клеток могут подвергаться мутациям, вероятность которых еще более увеличивается в пересадочной культуре таких тканей. В силу этого, наиболее предпочтительными объектами для клонального микроразмножения являются генетически стабильные апексы и пазушные почки стебля. Технологии размножения растений i vi находят широкое применение в размножении уникальных генотипов линий, гибридов, мутантов, трансгенных растений, хозяйственных сортов с целью массового получения оздоровленного посадочного материала, в исследованиях по проблеме морфогенеза. Со временем будет возрастать значение клонального размножения i vi лучших экземпляров взрослых лесных деревьев и плюсовых их форм, размножения гетерозиготных, расщепляющихся при скрещивании растений, а также использования этой технологии для сохранения редких и исчезающих видов Бутенко, . А. Атанасов также подчеркивает высокую экономичность этого метода, заключающуюся в возможности использования единичных и суперэлитных растений для обеспечения необходимого объема растений для различных целей Атанасов, . В основе клонального микроразмножения растений лежит регулирование морфогенеза с помощью экзогенных фитогормонов, при этом важным является оптимальное соотношение гормонов, в особенности ауксинов и цитокининов. Для каждого объекта устанавливается свой оптимальный уровень гормонов Бутенко, .