Межклеточная коммуникация в популяциях Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 при взаимодействии с растением-хозяином и в условиях голодания

• Автор: Горшков, Владимир Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.12, 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 187 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Г лава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль системы межклеточной коммуникации бактерий при взаимодействии с растениемхозяином

1.1.1. Феномен кворум сенсипга у бактерий

1.1.2. Модуляция межклеточной коммуникации

бактерий метаболитами растенияхозяина

1.1.3. Основные факторы вирулентности фитопатогенной бактерии Р. i и родственных видов

1.1.4. Регуляция продукции факторов вирулентности у Р. i и родственных видов

1.2. Адаптация бактерий

к неблагоприятным для роста условиям
1.2.1. Образование покоящихся форм микроорганизмов
1.2.2. Роль системы межклеточной коммуникации в формировании адаптивного ответа бактерий
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культивирование растений и их инфицирование
2.2. Культивирование бактерий
2.3. Оценка титра культивируемых клеток
Р. i
2.4. Условия экспериментов по влиянию метаболитов растений на систему кворума и продукцию факторов вирулентности
Р. i
2.5. Выделение ДИК из бактериальных клеток
2.6. Выделение и очистка ДНК из тканей растений
2.7. Выделение РНК и синтез кДИК
при помощи реакции обратной транскрипции
2.8. Амплификация участков ДНК Р. i 3 с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР
и IГЦР в реальном времени ПЦР РВ
2.9. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2 Определение титра геномных копий культур
Р. i 3
2 Определение уровня экспрессии генов
Р. i 3
2 Получение низкомолекулярной водорастворимой фракции растительного экстракта
2 Экстракция и детекция ацилгомосерин лактонов
2 Определение пектатлиазной активности
Р. i I
2 Получение покоящихся клеток Р. i 3
2 Оживление покоящихся клеток
Р. i I
2 Окрашивание клеток Р. i I витальными красителями и их анализ при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии
2 Приготовление проб для электронной микроскопии
2 Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние метаболитов растений на систему межклеточной коммуникации и продукцию
факторов вирулентности Р. i I
3.1.1. Гипотетическая схема активации системы кворума
Р. i I метаболитами растений
3.1.2. Влияние метаболитов растений па систему межклеточной коммуникации
Р. i I
3.1.3. Влияние метаболитов растений на пектатлиазную активность Р. i I
3.1.4. Влияние метаболитов растений на экспрессию генов системы секреции третьего типа
Р. i I
3.2. Адаптация Р. i I
к неблагоприятным условиям
3.2.1. Образование покоящихся форм
Р. i и их оживление
3.2.2. Матричные свойства надмолекулярных комплексов ДНК клеток Р. i I , находящихся
в различных физиологических состояниях
3.2.3. Фитопатогенносгь клеток Р. i 3, находящихся в различных физиологических состояниях
3.2.4. Особенности адаптивных реакций Р. i I в зависимости
от плотности популяции
3.2.5. Система межклеточной коммуникации Р. i I при адаптации
к условиям, неблагоприятным для роста
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В подобном поведении проявляются черты сходства бактерий с многоклеточными организмами. Одной из ключевых систем межклеточной коммуникации является система кворума или кворум сснсинг i , i, , регулирующая проявление различных бактериальных фенотипов в зависимости от плотности популяции. Фактически, межклеточная коммуникация позволяет множеству индивидуальных клеток синхронно проявлять одинаковый фенотип. Эффекторами системы кворума являются легко диффундирующие сигнальные молекулы, накапливающиеся при высокой плотности популяции и через сенсорные белки регулирующие экспрессию определенных групп генов. Классической моделью функционирования системы кворума является регуляция биолюминесценции у морской симбиотической бактерии Vii ii , iv, . Еиргутпа , где плотность популяции может достигать клетокмл . При высокой плотности популяции в окружающей среде накапливаются легко диффундирующие из клеток сигнальные аутоиндукторы ацилгомосерин лактоны АГЛ, которые индуцируют генерирование люминесценции этими микроорганизмами. По химической структуре АГЛ представляют собой лактоновое кольцо с ацильным радикалом от 4 до углеродных атомов i . Свечение культур V. Ключевая роль в кворумзависимой регуляции принадлежит генетической системе x Ix , кодирующей белки x и x, соответственно. Ген x кодирует синтазу АГЛ. Белок x является репрессором транскрипции своего гена и сенсором АГЛ. При взаимодействии с АГЛ данный белок начинает функционировать как активатор транскрипции шгоперона, в состав которого входит ген x и компоненты люциферазной системы. Поэтому при активации системы кворума происходит лавинообразное накопление аутоиндуктора и генерирование флуоресценции. Таким образом, регуляция системы кворума осуществляется по принципу положительной обратной связи, при которой увеличение концентрации аутоиндуктора приводит к индукции его синтеза. Система кворума V. По такому же принципу с теми или иными модификациями функционируют кворумзависимые системы у множества других грамотрицательных бактерий рис. Рис. Схема регуляции но принципу кворум сенсинга. При низкой плотности популяции и низкой концентрации АГЛ транскрипция кворумзависимых генов происходит на базовом уровне. В процессе увеличения плотности популяции АГЛ накапливаются и взаимодействуют с сенсорным белком. Комплекс АГЛсенсор активирует транскрипцию регулона системы кворума, в состав которого, в частности, входит ген АГЛсинтазы. В результате этого интенсифицируется продукция АГЛ, что приводит к еще большей активации системы кворума. В большинстве случаев взаимодействие аутоиндукторов и рецепторных белков приводит к индукции целевых генов однако у ii гомолог x , связываясь с целевой последовательностью ДНК в отсутствии АГЛ, действует как рсирсссор комплекс АГЛ снижает сродство к ДНК и подвергается протеолизу i а. У i связывается с промоторными областями генов как в отсутствии, так и в присутствии АГЛ, но в первом случае белок действует как репрессор транскрипции, а во втором как активатор i . У разных видов прокариот сигналы межклеточной коммуникации могут различаться. Грамположигельные бактерии в качестве сигналов межклеточной коммуникации используют сигнальные пептиды. У представителей рода i они регулируют процесс споруляции . Фитопатогенные бактерии родов i и X в качестве аутоиндукторов используют производные пальмитиновой кислоты . Многие организмы используют две или более систем кворума при участии различных аутоиндукторов, которые обычно отличаются по физичсскохимическим свойствам и предположительно передают различную информацию о внешней среде. Они, как правило, дифференциально регулируются и могут приводить к проявлению различных фенотипов . У морской бактерии Vii vi биолюминесценция регулируется двумя системами кворума, опосредованными АГЛ и аутоиндукторами второго типа АИ2 . Система кворума, зависимая от АИ2, широко распространена среди многих грамположительных и грамотрицательных бактерий и, как считается, присутствовала у этих групп микроорганизмов до их эволюционной дивергенции .