Взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы

• Автор: Верхотуров, Василий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.12, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Якутск
• Количество страниц: 200 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава I. Антиоксиданты растений.

1. Низкомолекулярные антиоксиданты.

1.1. Соединения, содержащие енольные группы.

1.2. Тиоловые соединения ингибиторы свободных радикалов .

2. Высокомолекулярные антиоксиданты.

Глава II. ероксндаза растений.

1. Строение фермента

2. Механизм действия фермента

3. Псроксидаза в реакциях совместного окисления субстратов
Глава III. Роль атноксидантов в формировании механизма покоя семян . .
1. Псрскиснос окисление липидов в онтогенезе растений
2. Состояние белоксингезирующей системы в покое и на начальных этапах
прорастания семян
3. Динамика содержания антиоксидантов и антиоксидантной активности на
конечных этапах эмбриогенеза.
4. Роль биологически активных веществ в формировании механизмов покоя
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. . .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Исходные вещества.
2. Использованная аппаратура.
3. Приготовление растворов.
4. Методика исследования.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Глава 1. Состояние антиоксидантной системы при прорастании семян
пшеницы.
1. Активность пероксидазы и содержание антиоксидантов при
набухании семян пшеницы
2. Активность пероксидазы и содержание антиоксидантов при
прорастании семян пшеницы
2.1. Каталитические свойства пероксидазы проростков пшеницы. 3. Роль пероксидазы и ннзкомолскулярных антиоксидантов в защите
проростков от окислительного стресса.
Глава II. Ннзкомолскулярные антиоксиданты субстраты пероксидазы. I. Псроксидаза в реакциях индивидуальною окисления
низкомолекулярных антиоксидантов.
1.1. Аскорбиновая кислота медленно окисляемый субстрат пероксидазы
1.2. Гидрохинон быстро окисляемый субсграт пероксидазы. . .
1.3. Изучение механизма псроксидазного окисления хлориромазина аминазина
2. Пероксидаза в реакциях совместного окисления субстратов. .
2.1. Механизм совместного пероксидазного окисления гидрохинона и аскорбиновой кислоты.
2.2. Реакции совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия.
2.3. Реакции совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и одианизидина
2.4. Механизм совместного пероксидазного окисления гидрохинона
и одианизидина
2.5. Реакции совместного пероксидазного окисления хлорпромазина и ферроцианида калия.
3. Роль низкомолекулярных антиоксидантов в регуляции
активности пероксидазы
3.1. Влияние квсрцстина на реакции пероксидазного окисления одианизидина.
3.2. Влияние норадреналина и викасола на реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и одианизидина
3.3. Сагшцилат натрия ингибитор пероксидазы в реакциях окисления ферроцианида калия и одианнзндина.
3.4. Участие днгоксина в реакциях пероксидазного окисления одианизидина
Глава III. Влияние низкомолскулярных антиоксидантов на всхожесть
семян пшеницы
1. Действие физических и химических факторов на прорастание семян
пшеницы.
2. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на физиологобиохимические показатели семян пшеницы при прорастании . . 6 3. Роль аскорбиновой кислоты при прорастании ссмяи пшеницы. .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Сгшсок сокращений
АДГ алкогольдегидрогеназа АК аскорбиновая кислота АМ аминазин хлорпромазнн
АО, АОС антиоксиданты, антиоксидантная система АФК активные формы кислорода Г 6ФДГ глюкозо6фосфат дегидрогеназа ГХ гидрохинон
Е, Еь Е2, фермент и его окисленные формы
КВ кверцетин
МДА малоновый диальдегид
НА норадреналин
ОДН одианизиднн
ПО пероксидаза
ПОЛ перекисное окисление липидов СОД супероксиддисмутаза ТБК тиобарбитуровая кислота ФР ферроцианид калия
и 8в глутатион и его окисленная форма
кс, кс каталитические константы скорости реакции окисления одной и двух молекул субстрата соответственно
Кю1, Кпй константы Михаэлиса при связывании одной и двух молекул субстрата соответственно
п количество молекул субстрата, ингибирующих псроксндазу Ут максимальная скорость Б, Р субстрат и продукт реакции а, 3 численные константы
I время, в течение которого происходит преимущественное окисление одного из субстратов
ВВЕДЕНИЕ
Семенам дикорастущих и культурных растений свойственно состояние вынужденного покоя. Такие семена при неблагоприятных условиях но прорастают совсем или имеют пониженную всхожесть. В этом случае пособность семян находиться в состоянии покоя обеспечивает растениям возможность переживать неблагоприятные для их существования периоды года 1. Однако с возрастанием оводненности в семенах активируются основные метаболические процессы, и повышается дыхание до максимального уровня, характеризующие их рост и развитие 2. Период прорастания семян делится на три этапа 1 активация метаболизма этап физического набухания семян 2 подготовка к началу роста растяжением наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша 3 собственно рост органов проростка 3.
Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей. В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода ОД Н, НО, НОС1 и др. 4. Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидныс радикалы модифицируют белки, нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие, функционально активные вещества. Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей 5. В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободноратикальных процессов и иерекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава и проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. Контроль над содержанием АФК в семенах осуществляют антиоксиданты 6.
При прорастании семян в них генерируются активные формы кислорода защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной
антиоксидантной системы в составе низко и высокомолекулярных соединений. К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся аминокислоты, дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др. В комплекс высокомолекулярной системы антиоксидантной зашиты входят ферменты каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др. Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях 7. Однако роль антиоксидантов в механизмах покоя и прорастания семян пшеницы мало изучена. Хотя известно, что многие из низкомолекулярных антиоксидантов могут быть субстратами перокендазы 8.
Являясь компонентами единой антиоксидантной системы растений, низко и высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать взаимное влияние. Например, низкомолекулярные антиоксиданты аскорбиновая кислота, кверцстин, гидрохинон и др. служат субстратами пероксидазы и окисляются ферментом в реакциях индивидуального и совместного окисления. Тогда как их высокие концентрации способны ингибировать фермент. Однако механизм этого взаимодействия недостаточно изучен 9.
Высокая активность пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза растений. Фермент способен катализировать окисление различных неорганических и органических соединений. Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы 1. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя. Однако мало изучена роль пероксидазы в механизме действия антиоксидантной системы в процессе
нрорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.
Актуальность


Перскисное окисление липидов это цепной радикальный процесс, инициирующий огрыв водорода от метильных групп, разделяющий олефиновыс связи в молекуле жирных кислот. На стадии развития цепной реакции образовавшийся алкильный радикал быстро взаимодействует с молекулой кислорода, образуя мероксильный радикал , который в свою очередь, инициирует появление нового алкильного радикала 6. Антиоксидантное действие а токоферола представлено взаимодействием с перекисным радикалом , при этом приводит к ингибированию развития цепной реакции. Молекула а токоферола способна отдавать атом водорода фенольной группы хроманового ядра сильному акцептору. В результате образуется гидропероксид жирной кислоты и токоферолысый радикал аТО,
который достаточно резонансно стабилизирован и поэтому не инициирует цепную реакцию , . Токоферол образует комплексы и со свободными жирными кислотами, при этом эффективность взаимодействия возрастает с увеличением степени ненасыщенности и оказывает значительное стабилизирующее действие мембраны. Одним из механизмов ингибирования процессов ПОЛ токоферолом является образование стабилизированного донорноакцепторного комплекса . Содержание эндогенных токоферолов в побегах пшеницы и риса значительно превышает его в корнях , . Обработка растений экзогенными токоферолами вызывала разнонаправленные изменения в регуляции ПОЛ в корнях и побегах. В зависимости от периода развития и состояния растения концентрации внутри АО, а также внешних условий, экзогенный токоферол может высту пать как АО, так и прооксидант ,. Аскорбиновая кислота, содержание которой в различных зеленых растениях, плодах и фруктах составляет мг0 г, может участвовать в окислительновосстановительных реакциях, выполняя роль донора и акцептора водорода 4. Витамин С в растениях может синтезироваться из глюкозы и с большей скоростью, из галактозы , . В клетках корней хрена АК сосредоточена в больших центральных вакуолях , много е в клеточном соке листьев ячменя . Содержание АК в хлоропластах и цитоплазме зависит от функционального состояния клетки и факторов внешней среды , . Антиоксидантные свойства аскорбата основаны на функционировании одноэлектронных циклических переходов между дигидро, семидигидро и дегидроаскорбатными формами, чему способствуют весьма подвижные протоны, скорость этих превращений зависит от металлов переменной валентности, других пар окислитель восстановитель и . Восстановленная
форма характеризуется способностью непосредственно взаимодействовать с АФК обезвреживает НОС1, тиильный и гиопероксильный радикалы, а также участием в восстановлении других низкомолекулярных антиоксидантов атокоферол, посредством неферментативных и энзиматических реакций. Аскорбат обезвреживает , , , Н, ОД превосходит другие антиоксиданты в защите липидов от иерскисного окисления , , . Н2СЬ может восстанавливаться аскорбатом как непосредственно, так и с помощью фермента аскорбатпероксидазы 7. Кроме этого окисление витамина С в клетке могут осуществлять шпохромоксидаза, фенолаза, лакказа , пероксидаза 9. Восстанавливаются окисленные формы аскорбиновой кислоты глутатионом, НАДГГ . С другой стороны, витамины А, С, и , при окислении и аутоокислении которых образуются промежуточные радикальные формы, могут выполнять роль инициаторов окисления и ускорять 1I1 . Большое внимание в исследованиях прооксидантных свойств витамина С уделяется его окислительновосстановительным реакциям с металлами переменной валентности. Так, система аскорбат во фракциях микросом инициирует ПОЛ, сопровождающееся генерацией по механизму Руссела, что подтверждается хемилюминесцентной детекцией. Кроме того, аскорбат может частично заменить Оi в восстановлении в реакции Габера Вейса, ответственной за синтез НО. На долю последнего относят основную часть сайтспецифичных повреждений биоструктур при развитии свободнорадикальных процессов . Проявление аскорбиновой кислотой анти или прооксидантных свойсгв зависит также от концентрации и условий протекания окислительных реакций такая сс функциональная пластичность важна для поддержания в биологических системах окислительновосстановительного гомеостаза.