Механизмы дифференцировки нервной ткани и межклеточные взаимодействия при нейротрансплантации у млекопитающих

• Автор: Александрова, Мария Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.11
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 220 с. : ил.

Оглавление.
Введение

Глава 1. Обзор литературы Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Закономерности дифференцировки нейронов при нейротрансплантации.

3.1. Кинетика развития, дифференцировка нейронов и архитектоника в трансплантатах эмбриональной ткани.
3.2. Закономерности экспрессии промежуточных филаментов нейрона в ходе дифференцировки при нейротрансплантации. Развитие аксонов.
3.3. Межнейрональные взаимодействия неокортикальных трансплантатов с мозгом реципиента.

3.4. Нейрохимическая дифференцировка клеток в трансплантатах.

3.4.1. Экспрессия кальций связывающих белков в нейронах неокортикальных трансплантатов.

3.4.2. Дифференциртка ЫРУ нейронов в неокортикальных трансплантатах.

3.4.3. Судьба допаминергических нейронов в неокортикальных трансплантатах.

Глава 4. Закономерности дифференцировки глиальных клеток в ткани нейротрансплантатов.
Глава 5. Адгезивные белки внеклеточного матрикса при нсйротрансплантацин.
Глава 6. Поведение клеток и тканевые взаимодействия при нейротрансплантацин.
6.1. Миграция клеток при нейротрансплантации.
6.2. Васкуляризация нейротрансплантатов.
6.3. Развитие неокортикальных трансплантатов в различных условиях эксперимента. Роль глиомезодермального барьера.
Глава 7. Трофическое взаимодействие трансплантатов эмбриональной нервной ткани с мозгом реципиента.
7.1. Нейротрансплантация в мозг млекопитающих с диффузной дегенерацией нейронов.
7.2. Нейротрансплантация животным с локальным повреждением мозга.
7.3. Влияние нейротрансплантатов на подавление судорожной активности у крыс с наследственной эпилепсией.
Заключение. Концепция механизмов дифференцировки нервной ткани и межклеточных взаимодействиях при нейротрансплантацин в мозг млекопитающих.
Выводы.
Список литературы


Затем тщательно отмывали в 3 сменах фосфатного буфера. Со вторыми антителами антимышиными в случае моноклональных антител и антикроличьими в случае поликлональных антизел инкубировали также но 1 часу при комнатной температуре. В рабочий раствор антител всегда добавляли нормальную крысиную сыворотку с целью снижения неспецифического связывания антител. Готовые препараты отмывали в 3 сменах фосфатного буфера по 5 минут, сушили минут в термостате, покрывали покровными стеклами и изучали во флуоресцентном микроскопе. При этом моноклональные антитела к виментину использовали без разведения, а поликлональные антитела к ГФКБ использовали в разведении 1. Нф. Срезы толщиной 56 мкм фиксировали в забуференном формалине в течение 3 минут, после чего препараты отмывали в фосфатном буфере в течение суток 4 смены буфера. На следующий день после фиксации срезы инкубировали с антителами. Дальнейшие операции были аналогичны описанным выше. Антитела к Нф были получены в институте Биолог ической и химической физики АН ЭССР, в г. Таллинн. Их использовали в разведении 1. При изучении внеклеточного матрикса в области трансплантации использоовали иммуногистохимический метод с использованием поликлональных антител к ламинину и фибронектину. Антитела были получены Любимовым . . в ВОНЦ АМН СССР, и были использованы в разведении 15 и 1 соответственно. В некоторых случаях использовали двойную метку к Нф и ЛАМ и к Нф и Фн. Для этого готовили рабочий раствор первых и вторых антител, в котором выполнялись пропорции рабочих разведений для каждого из них. В этом случае моноклональные и поликлональные антитела использовали одновременно в качестве первого слоя инкубации, затем отмытые в фосфатном буфере препараты инкубировали со вторыми антителами, представляющими собой смесь антимышиных и антикроличьих антител, конъюгированных с ФИТЦиТРИТЦ. Иммуногистохимическое исследование нейрохимической дифференцировки нейронов было проведено с применением антител прошв и нейропептидов vi V, ii , и тирозингидроксилазы . Для этого животных перфузировали транскардиально 4 параформом на фосфатном буфере. Мозги выделяли и помещали в фиксатор, затем в сахарозу и через сутки изготовленные на вибратоме коронарные срезы мозга толщиной 0 мкм инкубировали с мышиными моноклональными первичными антителами против 10, i, 1, i, С , V 1, i, и 10, , разведенными в с детергентом 0,1ный i Х0 и нормальной сывороткой лошади. Затем срезы инкубировали в растворе вторичных антител при разведении 10 и переносили в раствор авидинбиотинпероксидазного комплекса Vi i, V i . Обработку заканчивали выявлением пероксидазы комплекса, обезвоживанием в спиртах и заключением в X. Иммуногистохимическую окраску на тирозингидроксидазу ТГ проводили по следующей схеме перфузия холодным параформальдегидом 4, дофиксация в холодильнике часов, приготовление серийных фронтальных срезов мкм толщиной на криостате, инкубирование с первыми антителами против ТГ, затем ТГ антитела были мечены пероксидазаантилероксидазным методом ПАП и выявлены хромогеном 3,3диаминобензидином для визуализации . Трейсерные красители. МежнеЙрональные связи исследовали с применением трейсерных красителей. Помимо фермен га пероксидазы хрена о нем сказано выше использовали карбоцианиновый краситель 1,1 i3,3,3,3iii i, , I. , . Животных перфузировали 4 параформом на фосфатном буфере, выделяли мозг и дофиксировали в течении нескольких дней при комнатной температуре. Окрашивание осуществляли внесением кристаллов краски с помощью специальной тонкой иглы в трансплантат. Материал с внесенными красителями сохраняли в темноте при комнатной температуре в 4ном параформе на фосфатном буфере . i . Через 35 месяцев после нанесения краски ткань мозга резали на вибратоме.