Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции

• Автор: Комбарова, Светлана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 226 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОКСОКРАЩЕНИ Й

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Биология возбудителя дифтерии

1.1. Микробиологическая характеристика возбудителя дифтерии и принципы лабораторной диагностики.

1.2. Дифтерийный токсин основной фактор патогенности возбудителя дифтерии.

1.2.1. Структура и функции дифтерийного токсина

1.2.2. Генетика токсиногенеза С. сЛрИЖепае

1.2.3. Регуляция экспрессии гена дифтерийного токсина

Глава II. Основы микробиологического мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний
2.1. Фенотипические методы наблюдения за С. ИрЫкепае
2.2. Молекулярногенетические методы мониторинга возбудителя дифтерии и других инфекционных заболеваний
2.2.1. Маркеры, используемые при разработке методов молекулярной диагностики и типирования
2.2.2. Полимеразная цепная реакция как инструмент исследования генов микроорганизмов
2.2.3. Секвенирование ДНК
2.2.4. Рестрикционный анализ хромосомной ДНК и блотгибридизация нуклеиновых кислот.
2.2.5. Мультилокусный энзимный электрофорез энзимтипирование.
2.2.6. Методы типирования, основанные на технологии полимеразной
цепной реакции.
СОБСТВЕННЫ ЕИССЛЕДОВ АНИЯ.
Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Штаммы бактерий
3.2. Идентификация культур С. ii
3.3. Наблюдения по распространению С. сНрЫкепае на территории России
3.4. Реакция непрямой гемагглютинации.
3.5. Полимеразная цепная реакция
3.6. ПЦР с универсальными праймерами
3.7. Риботипирование
3.8. Мультилокусный энзимный электрофорез.
3.9. Секвенирование генов Юх и ЖхЯ
3 Фаговая конверсия.
3 Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава IV. Особенности циркуляции возбудителя дифтерии на территории России
4.1. Риботипы С. сИрЫкепае, зарегистрированные в России.
4.2. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами как ускоренный метод наблюдения за генетической структурой популяции С.
сИрЫкепае.
4.3. Структура популяции возбудителя дифтерии в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции
4.3.1. Периодичность эпидемического процесса дифтерийной инфекции.
4.3.2. Распространение биоваров токсигенных С. сИрЫкепае.
4.3.3. Генетическая структура штаммов возбудителя дифтерии, выделенных в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции.
4.3.4. Клональный состав популяции . ii.
Глава V. Патогенные свойства штаммов С. ii.
5.1. Уровень токсинообразования штаммов возбудителя дифтерии, распространенных в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции
5.2. Изучение нуклеотидной последовательности генов x и x.
5.2.1. Структура гена x.
5.2.2. Структура гена x
Глава VI. Генетическая структура нетоксигенных С. ii.
6.1. Распространение токсигенных и нетоксигенных С. ii на территории России.
6.2. Риботипы нетоксигенных С. ii, зарегистрированные в России
6.3. Эксперимент по лизогенной конверсии нетоксигенных С. ii в токсигенные i vi
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1. Риботипы С. ii, зарегистрированные в России
Приложение 2. Риботипы нетоксигенных С. ii.
ЛИТЕРАТУРА


ИрНМепае, ответственных за колонизацию, сформировался к концу х годов, когда стало очевидно, что в современном мире проблема борьбы с дифтерией сохраняет свою остроту и актуальность. В России уже в х годах прошлого века проводились исследования по изучению процесса колонизации, который осуществляется за счет факторов патогенности, отличных от дифтерийного токсина 7, 8, 9, , . В.В. Высоцким, Е. А. Шмелевой, И. Мазуровой при изучении с помощью методов фазовоконтрастной и электронной микроскопии особенностей субмикроскопической организации поверхностных структур . ЭЦМ1 и ЭЦМ2, ответственный за прилипание и удерживание бактериальных клеток на эпителии эукариотических клеток. Исследованиями, проведенными в е годы Костюковой, С. Р. Карась, Переверзевым установлена роль других, факторов патогенности, ответственных за колонизацию адгезинов, липид кордфактора, связывающих железо сидерофоров, различных ферментов ,,. Е.А. Шмелева на основе псптидогликана клеточной стенки нстоксигенного штамма . Кодивак для формирования антибактериального иммунитета, препятствующего дифтерийному бактерионосительству. С помощью иммуноферментного анализа, в котором в качестве антигена использован препарат Кодивак, проведено определение приобретенных естественным путем антибактериальных I, I и I антител , , . Показано, что снижение уровня противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотке крови людей способствует формированию в коллективе процесса носительства даже при выраженной напряженности антитоксического иммунитета. Дефицит противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотке крови определяет необходимость коррекции иммунитета не только с помощью анатоксина, но и бактериальных антигенов. Основные патогенные свойства возбудителя дифтерии определяются его способностью продуцировать белковый токсин, который подавляет синтез белка в чувствительных эукариотических клетках 1, 9, 0. Очищенный препарат дифтерийного токсина ДТ высокотоксичен для человека, кролика, морской свинки. Летальная доза составляет 0 мкгкг массы тела. ДТ синтезируется на мембраносвязанных рибосомах 2 и секретируется клетками дифтерийных бактерий в виде глобулярного белка с молекулярной массой 0, 1. Вначале в клетке синтезируется предшественник токсина длиной 0 аминокислот, затем происходит его посттрансляционная модификация от Нзконца молекулы отщепляется последовательность из аминокислот сигнальный пептид, после этого зрелый токсин выходит за пределы клетки. Полипепдидная цепь зрелого ДТ, состоящая из 5 аминокислот, включает две части фрагмент А молекулярная масса и фрагмент В молекулярная масса . Фрагмент А иначе его называют аминотермииальным, или каталитическим доменом С состоит из 5 аминокислот аминокислотные остатки рис. А. Фрагмент В карбоксильнотерминальный состоит из 4 аминокислот аминокислотные остатки. В свою очередь, фрагмент В включает два домена трансмембранный домен Т аминокислотные остатки и карбоксильнотерминальный, или рецепторсвязывающий домен аминокислотные остатки. В составе молекулы ДТ имеются также два дисульфидных мостика , которые связывают аминокислотные остатки и , а также и участок из аминокислот, содержащий три аргининовых остатка аргининовую петлю остатки 0, 2, 3. Фрагмент А связан с фрагментом В с помощью дисульфидного мостика и аргининовой петли аминокислотные остатки 0, 6, 7, 9,3. Рис. Линейная диаграмма молекулы дифтерийного токсина. Л. интактный токсин Б. Рис. О., . Начальным этапом взаимодействия ДТ с чувствительной эукариотической клеткой является связывание фрагмента В домена с поверхностными рецепторами. Клетки всех чувствительных организмов способны поглощать связанную молекулу ДТ посредством эндоцитоза. В кислой среде эндосом происходит изменение конформации домена Т, в результате которого он становится способным образовывать в эндосомальной мембране каналы, по которым ДТ проникает в цитоплазму клетки. В цитоплазме происходит протеолиз ДТ в области аргининовой петли рис. Б, в результате чего дисульфидные связи между фрагментами А и В восстанавливаются, фрагмент А отщепляется от фрагмента В.