Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий

• Автор: Пиксасова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология бифидобактерии . . .

1.2. Физиологобиохимические характеристики бифидобактерий

1.2.1. Отношение к кислороду

1.2.2. Оптимум температур.

1.2.3. Оптимум кислотности

1.2.4. Содержание сахаров в среде и метаболизм бифидобактерий .

1.2.5. Амилазы бифидобактерий.

1.2.6. Протеазы бифидобактерий

1.2.7. Состав клеточной стенки

1.2.8. Образование экзополисахаридов.
1.2.9. Поверхностные протеины. .
1.2 Образование бактсриоцинов
1.2 Устойчивость к желудочнокишечному стрессу
1.3. Таксономия бифидобактерий
1.4. Экология и использование бифидобактерий
1.5. Бифидобактерии как пробиотики и их использование в медицине
1.5.1. Болезни желудочнокишечного тракта и их профилактика с использованием
бифидобактерий.
1.5.1.1. Воспалительные заболевания кишечника и синдромы ЖКТ
1.5.1.2. Превентивная терапия диареи
1.5.1.3. Инфекция, вызванная i i, и возможные осложнения.
1 Пробиотики и лечение холестеролемии .
1.5.3. Рак
1.5.4. Использование пробиотиков при коррекции атопических заболеваний
1.5.5. Пробиотики и иммунитет слизистых оболочек.
1.6. Выделение штаммов. .
1.6.1. Накопительные среды для бифидобактерий
1.6.2. Селективные среды для бифидобактерий и используемые антибиотики.
1.6.2.1. Мупироцин
1.6.2.2. Цинрофлоксанин.
1.7. Идентификация бифидобактерий
1.7.1. Информация, используемая в бактериальной таксономии ММИ4ИМММЧНММН
1.7.2. Методы типирования ДК .
1.7.3. Методы, основанные на рестрикции ДНК
1.7.4. Методы, основанные на полимеразной ценной реакции
1.7.5. Секвенирование ДНК . .
1.7.6. Сравнительная характеристика некоторых молекулярных методов типирования бактерий МИ1МИИИИ1МИМММЧЧ4ММИ
1.7.7. Методы видового типирования бифидобактерий .,. .
1.7.8. Геи фруктозо6фосфатфосфокетолазы бифидобактерий как молекулярная
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Куль туры бактерий, использованные в данном исследовании
2.2. Питательные среды
2.2.1. Подбор состава питательной среды
2.2.2. Проверка селективности ципрофлоксацина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий
2.2.3. Проверка селективности мунироцина в отношении микроорганизмов, не относящихся к группе бифидобактерий.
2.2.4. Определение наиболее перспективного природного источника устойчивых форм бифидобактерий
2.2.5. Приготовление растворов и красителей
2.3. Выделение чистых культур бифидобактерий
2.4. Хранение штаммов.
2.5. Анализ устойчивости бифидобактерии к кислороду тест на аэротолерантность
2.6. Определение активности фруктозо6фосфатфосфокетолазы бифидобактерий
2.7. Определение продуктов метаболизма бифидобактерий при помощи газовой хроматографии
2.8. Флуоресцентная гибридизация i i I
2.9. Молекулярные методы идентификации бифидобактерий. .
2.9.1. Выделение ДНК
2.9.2. Родоспецифическая полимеразная цепная реакция
2.9.3. Видоспецифическая мультиплексная полимеразная цепная реакция.
2.9.4. Рестрикционный анализ
2.9.5. Секвенирование ДНК
2.9.6. Учет результатов секвеннрования и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей. . .
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ
3.1 Питательные среды, использованные при подборе условий культивирования
3.1.1 Проверка сред
3.1.2 Изменение морфологии клеток и колоний
3.2 Аэротолерантность
3.3 Тест на фруктозо6фосфатфосфокетолазу и определение продуктов метаболизма бифидобактерий.
3.4 Результаты проведения флуоресцентной гибридизации i i I для штаммов бифидобактерий
3.5 Молекулярные методы
3.5.1 Родоспецифическая ПЦР
3.5.2 Результаты рестрикционного анализа и сравнение данных с результатами мультиплексной видосиецифнчсской ПЦР
.3 Секвенирование и филогенетический анализ последовательиосгей генов рРНК
и x.
ВЫВОДЫ. . .
БЛАГОДАРНОСТИ.
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ .
ВВЕДЕНИЕ


Согласно результатам данного исследования, можно утверждать, что бифидобактерии используют пиру ват, образовавшийся в качестве интермедиата во фруктозо6фосфатфосфокетолазном пути, двумя способами. Первый путь редукция пирувата до Блактата. Активность Цлактатдегидрогеназ всех изученных штаммов специфически требовала присутствия фруктозо1,6дифосфата, что ранее было обнаружено у бактерии vi Vi, . Второй путь расщепление пирувата до ацетилфосфата и формиата под действием фосфорокластических ферментов. Часть образуемого здесь ацетилфосфата используется с образованием в итоге этилового спирта. Ранее также отмечали образование этилового спирта из сахаров бифидобактериями. Однако исследователи не проводили анализ культуральной жидкости на присутствие в ней формиата i . Количество используемого пирувата различалось от штамма к штамму. Превращение пирувата в лактат доминировало у одних, в то время как лактат не образовывался у других штаммов. Были также штаммы, у которых очевидно отмечались признаки работы обоих метаболических путей. На количество используемого тем или иным способом пирувата влиял состав субстратов. Например, три штамма отличались формированием преимущественно Цлактата из лактозы, нежели при росте на глюкозе. Три основных фактора, которые могут влиять на выбор пути использования углеводного субстата. Первый сравнительное количество фосфорокластичсского фермента и лактатдегидрогеназы. Анализ данного фактора является сложной задачей, так как все предыдущие попытки продсмонстировать присутствие фосфорокластического фермента в бесклеточном экстракте оказались безуспешными. Более вероятно, что данный фермент нестабилен и инактивируется в процессе приготовления бесклсточного экстракта Vi , . Второй фактор количество фруктозо1,6бифосфата в клетке. Таким образом, наиболее вероятное объяснение медленного роста некоторых штаммов бифидобактерий на среде с глюкозой в качестве основного источника углерода, в том, что у них наблюдается слишком низкие концентрации фруктозо6фосфата и АТФ внутри клетки для образования достаточного количества фруктозо1,6бифосфата, недостаток которого лимитирует активацию лактат дегидрогеназы. Последним, третьим фактором, регулирующим использование пирувата, может быть аффинность лактат дегидрогеназы и фосфорокластического фермента к пирувату. У культур, растущих на глюкозе, стационарные концентрации пирувата были почти вдвое выше, чем у тех, которые росли на лактозе. Разница в ферментативном балансе глюкозы и лактозы может объясняться тем, что аффинность фосфорокластического фермента к пирувату ниже, чем таковая лактат дегидрогеназы Vi i, . Известно два пути расщепления манншола в метаболизме бактерий. АТФ или фосфоенолпируват в качестве донора фосфатов маннитол фосфотрансферазы и маннитол1фосфат дегидрогщщзы . Конверсия маннитола до фруктозы под дейсгвием дегидрогеназы была описана для vi, xii, xi, i i и . Чаще всего дегидрогеназы представлят собой полиолдегидрогеназы, которые конвертируют как маннитол, так и сорбитол. Было показано, что первым этапом деградации маннитола бифидобактериями является расщепление его до фруктозы индуцируемой НАДзависимой полиолдегидроюназой и последующее фосфорилировние фруктозы до фруктозо6фосфага индуцируемой фруктокиназой . До исследований Томарелли в х годах XX века мировая наука обладала очень скудными данными о вещесгвах, необходимых для роста бифидобактерий. Несколькими годами позже вышла статья Норриса в соавторстве с Томарелли i . Присутствие в среде этих компонентов должно было, по их мнению, положительно повлиять на рост бифидобактерий. Ростостимулирующая активность каждого из внесенных нутриентов изучалась в ходе дальнейшей работы. Обнаружили, что на среде достаточно простой по составу, содержащей цистеин или цистин, штаммы бифидобактерий использовали соли аммония в качестве источника азота. По данным того же исследования из витаминов бифидобактериям требовались биотин и пантетонат кальция не было необходимости в добавлении пуринов и пиримидинов цистеин цистин требовался и не мог бьггь заменен какойлибо другой аминокислотой мегнонином, гомоцнегеином или сходными с ними по химическому строению, i .