Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР

• Автор: Шарова, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 128 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ. СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.утн совершенствования ПЦРдиагностики

инфекционных болезней

1.2. Лабораторная диагностика бруцеллеза.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов

2.2. Среды и условия культивирования.
2.3. Лабораторные животные.
2.4. Подготовка проб.
2.5. Бактериологический анализ.
2.6. Иммунологические методы лабораторной диагностики
2.7. ПЦРанализ
2.7.1. Выбор праймеров.
2 Выделение ДНК.г
2.7.3. Полимеразная цепная реакция.
2.7.4. Гельэлектрофорез.
2.8. Статистическая обработка полученных данных 4
Глава 3 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА МЕТОДОМ ПЦР
3.1. Подбор эффективных праймеров для создания
ПЦРтсстсистсмы и оптимизация условий реакции
3.2. Определение диагностической ценности ПЦРтестсисгемы в комиссионных испытаниях.
Глава 4 СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПЦР И БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ БРУЦЕЛЛЕЗЕ
Глава 5 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦРАНАЛИЗА ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ
КОНТИНГЕНТОВ РИСКА ПО БРУЦЕЛЛЕЗУ
Глава 6 ПРИМЕНЕНИЕ ПЦРАНАЛИЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ
МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ НА БРУЦЕЛЛЕЗ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Подобрать праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой кДа внешней мембраны бруцелл. ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность реакции. Разработать на основе оптимальных праймеров диагностическую тестсистему, позволяющую выявлять все виды бруцелл в биологическом материале, объектах внешней среды и молочных продуктах. Изучить диагностическую информативность разработанной тестсистемы при работе с материалом, полученным от зараженных животных. Сравнить эффективность бактериологического метода и ПЦР при исследовании материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, а также органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, зараженных различными видами бруцелл. Определить возможность использования ПЦРанализа в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики для обследования контингентов риска по бруцеллезу. Сравнить эффективность различных способов выделения и очистки ДНК. ПЦРанализс молока и молочных продуктов. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тестсистемы при исследовании молочных продуктов, искусственно инфицированных возбудителем бруцеллеза. Разработана тсстсистсма с праймерами ВшВги и ВгиЗВги4 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего ситгтез белка молекулярной массой кДа внешней мембраны бруцелл, для исследования биологического материала и объектов внешней среды на наличие возбудителя бруцешеза методом двухстадийной гнездовой ПЦР. Доказана ее высокая специфичность и чувствительность при работе с чистыми культурами возбудителя бруцеллеза 1 ж 2 1x м. У мл и объектами, искусственно инфицированными бруцеллами 1х3 м. Показано преимущество ПЦРанализа с использованием разработанной тестсистемы при исследовании органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, зкеперимеггтально зараженных бруцеллезом, и материала, искусственно контамгазированного бруцеллами. Определены наиболее эффективные способы подготовки проб, обеспечивающие высокую степень экстракции и очистки ДНК при исследовании молочных продуктов методом ПЦР. Впервые показана возможность выявления ДНК возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с предложенной тестсистемой в молочных продуктах сливках, сырс. На диагностический набор Тестсистема для выявления ВгисеИа рр. По программе, утвержденной комитетом МИБП, проведены Государственные приемочные испытания протокол 2 от г. Результаты Государственных испытаний одобрены ученым советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича протокол 7 от г. Получено разрешение комитета МИБП на внедрение препарата в практику здравоохранения протокол . Материалы диссертации используются при чгении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по ПЦРдиагностике при Российском научноисследовательском противочумном институте Микроб. I. ППРтестснсте. . По эффективности, чувствительности и быстроте выполнения ПЦРанализ с использованием разработанной тсстсистсмы превосходит бактериологический метод как при исследовании объектов, искусственно контаминированных возбудителем бруцеллеза, так и биологического материала от экспериментально зараженных животных. При обследовании контингентов риска по бруцеллезу животноводов хозяйств неблагополучных по бруцеллезу КРС и работников мясокомбината ПЦРанализ обладает большей диагностической точностью по сравнению с Традиционными серологическими методами лабораторной диагностики. Использование разработанной схемы ПЦРанализа позволяет выявлять возбудитель бруцеллеза в молоке и молочных продуктах с чувствительностью 1x 1хЮ4 м. Материалы диссертации доложены и представлены на научнопрактической конференции, посвященной 0летию образования противочумной службы России Саратов, II Всероссийской конференции Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний Москва. II Всероссийской конференции Гомеостаз и инфекционный процесс Саратов, Международной научнопрактической конференции Проблемы санитарноэпидемиологической охраны территории стран СНГ Саратов.