Секретируемые белки (Yop), кодируемые плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы : Выделение и изучение иммунобиологических свойств

• Автор: Микеров, Анатолий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава. РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА I VI СЕКРЕТИРУЕМЫХ БЕЛКОВ , КОДИРУЕМЫХ ПЛАЗМИДОЙ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМОСТИ II .

1.1. Факторы вирулентности, кодируемые плазмидой кальцийзависимости

1.2. Статус и особенность их экспрессии i vi

у . i

1.3. Генетический контроль экспрессии i vi

Глава 2. РОЛЬ БЕЛКОВ В ВИРУЛЕНТНОСТИ ИЕРСИНИЙ

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы
3.2. Питательные среды, препараты, реактивы
и оборудование.
3.3. Методы исследований
Глава 4. КИНЕТИКА ПРОДУКЦИИ И ВЫДЕЛЕНИЕ В ОЧИЩЕННОМ ВИДЕ БЕЛКОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.
4.1. Иммунный ответ у кроликов на белки . i.
4.2. Кинетика продукции i vi белков у . i.
4.3. Выделение белков из внешней мембраны
. i
Глава 5. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ
, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ . I.
Глава 6. УЧАСТИЕ БЕЛКОВ В ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСТРОЙКЕ У ЛЮДЕЙ, ПРИВИТЫХ ЖИВОЙ ЧУМНОЙ ВАКЦИНОЙ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК Л И Г Е Р А Т У Р Ы
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВМ внешняя мембрана
ДСН додецилсульфат натрия i
ЖЧВ живая чумная вакцина кДа килолальтон КЖ культуральная жидкость КОЕ колониеобразуюшие единицы
ПАА1 ДСП электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН
ПЯЛ долиморфноядерные лейкоциты
РБТЛ реакция бласттрансформации лимфоцитов
т.п.н. 1ысяча дар нуклеотидов
УЗД ультразвуковой дезинтеграт
I питательный бульон i ii
кальцийзависимый фенотип i
кальиийнезависимый фенотип i i
конкаиавапин vi
ii i 2i ,, i i I тврдофазный иммуноферментный метод i i V, , I, г.п.н. плазмида кальцийзависимости i i
специфические шапсроны белков ii
тсмпсратурочувствитсльный фенотип iiv
элемент аппарата секрециитранслокации ii
ii i или секретируемые белки протеинкииаза А иерсиний ii ii Д
белки, участвующие в секреции i
белки, участвующие в регуляции низкого кальциевого ответа i
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ


ВГ, в процессе культивирования бактерий при С в питательном бульоне В1И с добавлением 5 мМ и мМ 2 белки на первом этапе продукции секретируются в культуральную жидкость КЖ, а на втором накапливаются во внешней мембране ВМ. Анализ количественного распределения белков между КЖ и ВМ срок исследования ч позволил сделать заключение о целесообразности выделения из ВМ . Из ВМ . КМ 3 впервые в препаративных количествах получены элсктрофорстически и иммунохимически чистые препараты белков . На модели мышеи впервые проведено комплексное исследование иммунобиологических свойств белков , , и возбудителя чумы, выделенных в очищенном виде. Установлено, что парентеральное введение мышам препаратов приводит к активизации кроветворных процессов и развитию морфологических признаков иммунобиологической перестройки, прежде всего, в селезнке. В то же время, введение мышам приводит к значительному снижению пролиферативной способности i vi их спленоцитов в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном СопА и патологическим изменениям в почках. При изучении иммуногенных свойств выявлено, что все изучаемые препараты стимулируют развитие гуморального, , и клеточного звена иммунитета, но не обеспечивают защиту мышей от вирулентных бактерий чумы У. Впервые показано, что белки , и i участвуют в иммунобиологической перестройке у людей, привитых живой чумной вакциной выявлено, что введение вакцины стимулирует выработку антител к и вызывает появление сенсибилизированных к этим белкам Тлимфоцитов. На модели зернистых лейкоцитов человека впервые изучено действие препаратов на состояние лизосомального аппарата фагоцитирующих клеток. Установлено, что и, в меньшей степени, вызывают секреторную дегрануляцию зернистых лейкоцитов, в то время как и не обладают таким действием. По результатам работы составлены методические рекомендации Получение очищенных препаратов белков из внешней мембраны бактерий ii i методом электроэлюции, которые одобрены учным советом Российского научноисследовательского противочумного института Микроб протокол 9 от 9 декабря г. РосНИПЧИ Микроб но учрежденческому уровню внедрения. Разработанные методические примы используются в работе отдела ПОДГОТОВКИ и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям РосНИПЧИ Микроб, о чм свидетельствует соответствующий акт о внедрении утверждн зам. В препаративных количествах выделены электрофоретически и иммунохимически чистые препараты белков , , и возбудителя чумы и получены поликлональные моноспецифические мышиные сыворотки к ним. Кроме того, получен набор поликлональных полиспецнфических человечьих и кроличьих сывороток, содержащих антитела к белкам . Указанные препараты могут быть использованы для получения моноклональных антител, а сыворотки для исследования экспрессии у У. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на Научнопрактической конференции, посвящнной 0летию образования противочумной службы России Саратов. II Всероссийской научной конференции Гомеостаз и инфекционный процесс Саратов, и 7 Ii ii i, , . ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. СТРУКТУРА И ОБЪМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 2 страницах машинописного текста, состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырх глав собственных исследований в т. Работа иллюстрирована рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает отечественных и 7 зарубежных источников. Разработан комплекс методических примов условия культивирования бактерий, электрофорез, электроэлюция, позволяющих получать в препаративных количествах электрофоретически и иммунохимически гомогенные препараты белков из внешней мембраны . КМ 3 . Препараты белков и , по сравнению с и , обладают более выраженной иммунобиологической активностью в отношении мышей, о чм свидетельствуют выработка наиболее высоких титров специфических антител и развитие клеточного иммунного ответа у мышей, привитых , с одной стороны, и значительное снижение пролиферативной способности ii vi спленоцитов и патологические изменения в почках при введении животным препарата с другой. Иммунизация мышей препаратами , , и в условиях проведнного эксперимента не обеспечивает им защиту от вирулентных бактерий чумы У.