Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов

• Автор: Маликова, Лилия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 160 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Сернновые протеиназы

1.1. Характеристика и классификация субтилизиноподобных протеиназ

1.2. Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл

1.3. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.

2. Функциональная роль внеклеточных протеиназ

микроорганизмов

3. Особенности биосинтеза бактериальных протеиназ

4. Применение протеолитнчсских ферментов.
5. Бактериальные альдолазы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИСС ЛЕДОВ АНИЯ
1. Подходы для повышения уровня продукции бактериальных протеиназ и альдолаз.
1.1. Оптимизация питательных сред для эффективного синтеза протеиназ В.атуодиеасепя и В.ритИш.
1.1.1. Динамика роста, биосинтеза сериновых протеиназ и спорообразования культур В.атуодиеасепз и В.ритиз.
1.1.2. Влияние пептона и неорганического фосфата на продукцию протеиназ В.атуодиеасепз и В.ритиз
1.1.3. Влияние солей аммония на биосинтез протеиназ В.атуодиеасепз и В.ритиз
1.1.4. Влияние белковых субстратов и дрожжевого экстракта на биосинтез протеиназ В.апуоиеасепз и В.ритиз.
1.1.5. Влияние аминокислот на продукцию субтилизиноподобных протеиназ В.ритиз
1.1.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на продукцию субтилизиноподобных протеиназ В.ритиз
1.2. Получение рекомбинантных штаммовпродуцентов трансальдолазы В.зиЫШз и фруктозо6фосфатальдолазы А9Б Е.со
2. Выделение и очистка ссриновых протеиназ и альдолаз
2.1. Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз .ii и В.ритиз.
2.2. Выделение и очистка трансальдолазы В.зиЫШзи фруктозо6фосфат
альдолазы А9Б Е.со
3. Характеристика ферментов
3.1. Влияние ингибиторов на активность сериновых протеиназ
В.атуодиеасепз и В.ритиз.
3.2. Энзиматические свойства сериновых протеиназ В.атуодиеасепз и В.ритиз
3.3. Субстратная специфичность сериновых протеиназ В.атуодиеасепз и В.ритиз
3.4. Фибринолитическая, тромболитическая и антикоагулянтная
активность сериновых протеиназ В.атуодиеасепз и В.ритиз
3.5. Способность субтилизиноподобных протеиназ В.атуодиеасепз к ферментативному синтезу пептидных связей
3.6. Синтетическая активность трансальдолазы В.зиЫШз и фруктозо6фосфатапьдолазы А Е.со
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
БЛАГОДАРНОСТИ.
ЛИТЕРАТУРА


Наиболее многочисленны и хорошо изучены представители кланов А и В. Белки клана А произошли от общего предка химотрипсина. Порядок расположения аминокислот в каталитической триаде молекул этих белков i. В клан В входят представители субтилизиноподобных семейств субтилизины. Субтилизины отличаются другим порядком аминокислот в каталитической триаде i. Оба семейства обширны и объединяют протеиназы с резко отличающимися свойствами. Из всего многообразия протеиназ рассмотрим более подробно семейства субтилизиноподобных ферментов клан В и глутамилэндопептидаз клан А. Продуцентами субтилизиноиодобных протеиназ являются представители многих эволюционных групп вирусов, архебактерий, стрептомицетов, эубактерий, грибов, дрожжей, растений, насекомых и млекопитающих , i, i, i, Руденская, . Зрелые белки содержат до остатков, их концевые каталитические домены состоят из 81 остатков, сигнальные пептиды достигают в отдельных случаях 0 аминокислот. Большинство субтилаз синтезируется в качестве препептидов, которые затем транслоцируются через клеточную мембрану с помощью сигнального пептида и активируются при отщеплении пропептида. Сходство аминокислотных последовательностей различных видов субтилизинов, консервативность большинства из существующих замен и похожая субстратная специфичность приводит к выводу о сходстве пространственных структур различных субтилизинов. Это показано рентгеноструктурными данными. При сравнении пространственных структур субтилизинов и Карлсберг, термитазы и протеиназы К, был выявлен структурно консервативный остов из 1 остатка, из которых являются высококонсервативными. Все субтилизины обладают характерным способом укладки полипептидной цепи в пространстве. Ядро фермента содержит около 0 остатков, образующих пять параллельных i, i, . Семейство субтилизина. К этому семейству относятся белки, в основном микробного происхождения, в частности, ферменты представителей рода i. Семейство термитазы субтилизины, действующие в экстремальных условиях их представители обнаружены только в микроорганизмах, в том числе в термофилах и галофилах. Семейство протеиназы К. Представители этого семейства найдены только в грибах, дрожжах и грамотрицательных бактериях. У некоторых ферментов этого семейства отсутствует участок, ответственный за связывание с ионом Са2. Кроме того, в литературе описаны семейства пептидаз лантибиотиков, кексинов и пиролизина i, i, . Субтилизины и субтилизиноподобныс протеиназы бацилл Наиболее детально изучены субтилизиноподобные протеиназы, сскретирусмые бактериями из рода i. Впервые эти ферменты были выделены из клеток . Позднее подобные ферменты были обнаружены и у других видов бацилл. Хорошо изученными внеклеточными сериновыми протеиназами являются субтилизин Карлсберг, полученный из . из . , v, . Гомология этих ферментов составляет , зрелые ферменты содержат 5 и 4 Карлсберг аминокислотных остатков. В протеиназе имеется два Сасвязывающих центра, в протеиназе Карлсберг их три i . . Из культуральной жидкости . А и . Субтилизин имеет высокую степець гомологии с субтилизином Карлсберг, ферменты имеют сходные физикохимические свойства . В китайском соевом блюде обнаружена протеиназа , продуцируемая . 4, с молекулярной массой кДа и i 8,0 . Было показано, что терминальных аминокислотных остатка субтилизина идентичны концевой последовательности субтилизина . Щелочная сери новая протеиназа . Е является гомологом термитазы из i vi. Термитаза отличается от по 7 положениям аминокислот, хотя только 8 замен было бы достаточно для того, чтобы субтилизин Е стал термостабильным. , , . Другим гомологом термитазы является термостабильная субтилизиноподобная протеиназа Ак1 штамма i . . . Эта протеиназа уникальна тем, что содержит дисульфидную связь в сайте связывания с субстратом.