Получение рекомбинантного белка внешней мембраны OprF Pseudomonas Aeruginosa и изучение его иммунобиологических свойств

• Автор: Злыгостев, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : 12 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Роль .i в инфекционной патологии человека

Глава 2. Основные факторы патогенности и антигенные структуры

синегнойной палочки.

Глава 3. Перспективы разработки генноинженерных вакцин против

бактериальных инфекций

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Материалы
4.1.1. Использованные штаммы
4.1.2. Экспериментальные животные.
4.1.3. Протеины и сыворотки.
4.1.4. Оборудование.
4.1.5. Реактивы.
4.2. Методы.
4.2.1. Выделение геномной ДНК .i
4.2.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР
4.2.3. Трансформация клеток .i
4.2.4. Выделение плазмидной ДНК микровариант
4.2.5. Определение нуклеотидной последовательности
4.2.6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли.
4.2.7. Иммуноблоттингi
4.2.8. Иммунофермеитный анализ ИФА
4.2.9. Получение иммунных сывороток.
4.2 Статистические методы.
Глава 5. Получение рекомбинантного белка наружной мембраны ОргБ Р.аепоБа
5.1. Клонирование гена рекомбинантного белка ОргР.
5.2. Получение рекомбинантного белка ОргР.
5.3. Характеристика специфичности полученного рекомбинантного
белка ОргР
Глава 6. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного белка ОргР
6.1. Изучение антигенных свойств рекомбинантного белка ОргР
6.2. Изучение токсичности рекомбинантного белка ОргР
6.3. Изучение протективных свойств рекомбинантного белка ОргР Глава 7. Изучение свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку ОргР Р.аегщпоза
7.1. Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку ОргР .
7.2. Изучение антибактериальных свойств иммунных сывороток к рекомбинантному белку ОргР
7.3. Оценка внутривидовой специфичности полученных иммунных
сывороток к рекомбинантному белку ОргР
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Установлено, что некоторые из них индуцировали иммунный ответ и обладали протективной активностью против бактериемии, вызываемой Р. Особый интерес представляет белок наружной мембраны i , участвующий в формировании пор микроорганизма. Его аминокислотная последовательность является высококонсервативной для представителей рода . .i, . ДР Это обстоятельство обуславливает целесообразность изучения иммунобиологических свойств белка для создания вакцины широкого спектра действия против различных видов , , , 7. При использовании традиционных методов, когда для создания вакцин из бактериальной клетки необходимо выделить протективные антигены, возникает ряд проблем. Вопервых, процентное отношение прогективных антигенов в составе клетки микроорганизма незначительно, и поэтому при культивировании необходимы большие объемы биомассы, а также необходимы многостадийные методики очистки и концентрирования, что обуславливает высокие производственные затраты. Вовторых, не гарантировано полное отсутствие примесей обеспечивающих неблагоприятные реакции организма. В последнее время при создании вакцинных препаратов все большое внимание уделяется использованию генноинженерных методов, суть которых заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез протективных антигенов в возбудителях, в геном непатогенной бактерии например, ii i, vii и др. Во время культивирования полученных продуцентов, в большом количестве синтезируется протективный антиген, который подвергается простой очистке и может использоваться для приготовления вакцины. Такая стратегия позволяет вычленить и использовать наиболее иммуногенные компоненты бактерии, а при производстве вакцин исключает контакт сотрудников с культурами патогенных микроорганизмов, что является существенным технологическим преимуществом, обеспечивающим безопасность персонала. вируса простого герпеса 0. В последние годы для вакцинации населения против вирусного гепатита В применяются препараты на основе дрожжевых рекомбинантных белков например Энджерикс В 2, 7. При создании генноинженерных вакцин обязательным условием является наличие достоверной информации об иммуногенности определенных белков и кодирующих их нуклеотидных последовательностях 6. Как уже отмечено выше, были исследованы иммунобиологические свойства большого спектра выделенных антигенов, имеющихся в структуре . Кроме того, геном 6, млн. РА полностью отсеквенирован и представлен в базе данных i АЕ. Поэтому в настоящее время зарубежными исследователями проводятся работы по созданию вакцин с использованием генов белков наружной мембраны . Изучение таких препаратов показало их высокую иммуногенность и безвредность , 9, 7. Цель работы Получение рекомбинантного белка. наружной мембраны . Выделить геномную ДНК . с помощью ПЦР, встроить его в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках . Наработать и хроматографически очистить рекомбинантный белок . Изучить иммунобиологические свойства рекомбинантного белка . Получить иммунные сыворотки и изучить их превентивные свойства. Получен непатогенный бактериальный продуцент . наружной мембраны . Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка содержала дополнительных 6 гистидиновых оснований, необходимых для ионноафинной хроматографии на iагарозном сорбенте, что позволило выделить высокоочищенный препарат. Очищенный рекомбинантный белок в реакции ИФА проявлял высокое специфическое взаимодействие с различными иммунными сыворотками, содержащими антитела к штаммам . ivi. Иммунизация очищенным рекомбинантным белком стимулировала у животных выработку специфических антител, а полученные к нему иммунные кроличьи сыворотки обладали протсктивными свойствами. Выявлена перекрестная активность иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку на моделях торможения роста культур . . Созданный штаммпродуцент Е. наружной мембраны .